雌激素对高糖诱导的HepG2细胞ACAT2表达的影响

张闻宇，张素华，李 蓉，龚莉琳

(1郑州市人民医院，郑州 450003;2重庆医科大学附属第一医院)

绝经后女性心血管事件发病率明显升高，而接受雌激素治疗后冠脉钙化的程度明显减轻［1］。雌激素对血脂和脂蛋白浓度均产生有益的影响，对动脉粥样硬化有预防作用，但其机制十分复杂，可能部分与调节肝脏胆固醇代谢有关。酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶(ACAT)是广泛存在于真核细胞中的一种膜结合酶，能催化胆固醇与长链脂肪酸连接生成胆固醇酯，参与胆固醇的代谢，其包括ACAT1和ACAT2两种同工酶，ACAT2主要存在于肝细胞中［2］。已证实ACAT2活性升高与动脉粥样硬化程度密切相关，而雌激素预防动脉粥样硬化的作用也与其调节 ACAT2的活性有关［3］。2011～2012年，我们观察了雌激素对高糖诱导人HepG2细胞ACAT2表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 17-β雌二醇购于 Sigma公司;HepG2细胞由第三军医大学生物化学教研室提供;DMEM购于Gibco公司;兔抗人ACAT2多克隆抗体DM54由TaYuan Chang博士惠赠;辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司;SuperscriptⅡ逆转录酶、lipofectamine2000购于 Invitrogen公司;Tripure购于Roche公司;PVDF膜购于美国Bio-Rad公司;实验中部分引物用Primer premier5.0软件设计，由上海生工生物技术公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 将 HepG2细胞置于DMEM(低糖)培养基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)，于37℃、5%CO2细胞培养箱内，以0.7×106/L接种六孔培养板内过夜培养后，加入无血清培养基继续培养24 h。将细胞分为四组，对照组加入正常培养基，甘露醇组加入终浓度为25 mmol/L甘露醇溶液，高糖组加入的葡萄糖溶液培养基孵育12 h;雌激素组用含总浓度25 mmol/L葡萄糖的培养基与细胞孵育4 h后，再加入终浓度为1×10－8mol/L 17β-雌二醇孵育8 h。

1.2.2 ACAT2 mRNA检测 采用 RT-PCR法。常规方法提取HepG2细胞总RNA，进行逆转录，按照SuperscriptⅡ说明书完成。取 cDNA 2 μL，PCR 扩增目的片段。其中ACAT2采用巢式PCR扩增，扩增条件为:94℃预变性15 min;94℃变性30 s，退火56℃(ACAT2第一轮)/58℃(ACAT2第二轮)/57℃(β-actin)，30 s;延伸 72 ℃、30 s;28cycle(β-actin)/30cycle(ACAT2);后延伸 72℃、10min。ACAT2第一轮上游引物5'-TTTCTCCAGCTACCTCTAC-3'，下游引物 5'-ATGACGGGATAGAAGAACC-3';ACAT2第二轮上游引物5'-CCTAGGACGCCCTATGTCAG-3'，下游引物 5'-GGACGTTGAGTTCCACCAGT-3'，扩增片段长度为300bp。β-actin上游引物5'-TCCCTCAAGATTCTCAGCA-3'，下 游 引 物 5'-ACATCCACAACGCATACA-3'，扩增片段长度为293 bp。PCR产物用1%琼脂糖凝胶鉴定。ACAT2 mR-NA与同组β-actin mRNA扩增条带光密度比值即为ACAT2 mRNA相对表达水平。

1.2.3 ACAT2蛋白检测 采用 Western blotting法。提取细胞总蛋白(操做方法见说明书)后取50 μg进行SDS-PAGE(10%)电泳。电泳完毕半干式转移(13 V，1 h)至PVDF膜上，4℃封闭1 h。一抗4 ℃孵育过夜(ACAT2 1∶100)，二抗(1∶5 000)室温孵育1 h。DAB显色。ACAT2与同组GAPDH条带光密度比值即为ACAT2蛋白相对表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件，所得数据比较采用t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组ACAT2 mRNA及蛋白表达见图1、图2;其表达水平见表1。

图1 ACAT2 mRNA表达

图2 ACAT2蛋白表达

表1 各组ACAT2 mRNA及蛋白表达水平(±s)

表1 各组ACAT2 mRNA及蛋白表达水平(±s)

注:与对照组相比，*P ＜0.001;与高糖组相比，#P ＜0.001

组别 ACAT2 mRNA ACAT2蛋白雌激素组 0.492 ±0.007# 0.745 ±0.031#高糖组 0.759 ±0.007* 0.873 ±0.020*甘露醇组 0.506 ±0.005 0.531 ±0.027对照组0.502 ±0.001 0.537 ±0.021

3 讨论

女性绝经后体内雌激素减少导致的胰岛素抵抗是心血管疾病和2型糖尿病(DM)在绝经后女性发病率增加的中间环节［4］。绝经后女性TC、TG、LDLC升幅和高脂血症患病率高于同年龄段男性，表明雌激素水平的降低是导致血脂升高的一个重要因素。

ACAT2是一种可被诱导表达的酶，主要分布于肝脏和小肠。正常情况下成人肝脏ACAT2的活性较低［5］。肝细胞ACAT2催化生成的胆固醇酯是构成新合成VLDL的脂核所必需。高胆固醇喂饲的动物，冠状动脉发生AS的程度与肝中的胆固醇酯的数量呈正相关，提示ACAT2的低活性对机体具有保护作用［6］。ACAT2的活性主要随基因转录和翻译的变化而改变［2］。本研究中高糖组 ACAT2 mRNA和蛋白的表达升高，部分解释了2型DM易出现血脂异常的可能原因。

Galipeau等［7］研究发现，高果糖喂养的去势雌性大鼠空腹血糖、血压均升高;而雌激素替代的同时高果糖喂养的去势雌性大鼠却未出现血糖、血压升高等代谢综合征的表现。表明雌激素能够抑制高果糖饮食所诱导的空腹血糖升高、糖耐量异常、血压升高。Campbell等［8］发现卵巢切除的雌性 Sprauge-Dawley(SD)大鼠的股四头肌葡萄糖的摄取下降，糖原合成减少，予雌激素替代后恢复正常;雌激素还能够抑制肝脂酶的活性，使HDL分解减少，并促进载脂蛋白apoA1的合成;同时通过上调肝内LDL受体及加速LDL清除而降低LDL，对血糖、血脂等有明显的调节作用。本研究结果显示，生理浓度的雌激素对高糖诱导的HepG2细胞ACAT2 mRNA和蛋白表达均有下调作用，提示雌激素对HepG2细胞中ACAT2活性的影响可通过转录和转录后调节作用实现。

［1］Anderson GL，Limacher M，Assaf AR，et al.Effects of conjugated equine estrogen in postmenopausal women with hysterectomy:the Women's Health Initiative randomized controlled trial［J］.JAMA，2004，291(14):1701-1712.

［2］Kavanagh K，Davis MA，Zhang L，et al.Estrogen decreases atherosclerosis in part by reducing hepatic acyl-CoA:cholesterol acyltransferase 2(ACAT2)in monkeys［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29(10):1471-1477.

［3］Rudel LL，Haines J，Sawyer JK，et al.Hepatic origin of cholesteryl oleate in coronary artery atherosclerosis in African green monkeys［J］.Enrichment by dietary monounsaturated fat［J］.J Clin Invest，1997，100(1):74-83.

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［5］Zhu QZ，Hou ZC，Rui FY，et al.Regulation of acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase 2 expression by saturated fatty acids［J］.Chin Med Sci J，2010，25(4):222-227.

［6］Lee RG，Shah R，Sawyer JK，et al.ACAT2 contributes cholesteryl esters to newly secreted VLDL while LCAT adds CE to LDL in mice［J］.J Lipid Res，2005，46(12):1205-1212.

［7］Galipeau D，Verma S，McNeill JH.Female rats are protected against fructose-induced changes in metabolism and blood pressure［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，283(6):2478-2484.

［8］Campbell SE，Febbraio MA.Effect of the ovarian hormones on GLUT4 expression and contraction-stimulated glucose uptake［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2002，282(6):1139-1146.