人巨细胞病毒截短被膜磷蛋白pp65的原核表达及抗原性分析

(山东省医学科学院基础医学研究所，山东省罕少见病重点实验室，济南 250062)

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)属疱疹病毒β亚科，人类对其普遍易感，大多终身呈隐性感染或潜伏感染［1］。在孕妇，HCMV原发或复发感染均可引起新生儿宫内感染或围产期感染，导致胎儿畸形、先天性耳聋、智力低下和发育迟缓［2］;在免疫低下者(如器官、骨髓移植患者，艾滋病患者)，HCMV可导致高热、白细胞减少、视网膜炎、肺炎、脑炎等严重疾病［3］。因此HCMV的早期检测具有重要临床意义。HCMV病毒颗粒包含至少33种结构蛋白，其中以UL83编码的低基质磷酸化蛋白pp65含量最为丰富［4］。pp65蛋白是一种晚期结构蛋白，在感染早、中、晚期均有表达，其在病毒复制晚期出现高表达是HCMV活动性感染的一项早期指标。通过pp65抗原血症检测病毒是否为活动性感染，是新近被广泛接受的相对“金标准”。另外，pp65蛋白是 HCMV特异性细胞毒性T细胞(CTL)的最主要靶分子［5，6］，其既能诱导特异性抗体的产生，亦能诱导机体的细胞免疫应答，已成为疫苗研制和免疫治疗的首选。2012年5月，我们利用大肠杆菌表达系统对pp65蛋白中抗原性强及特异性高的亲水性片段(321aa-562aa)进行了表达、纯化及初步抗原性鉴定，旨在为HCMV 检测试剂盒的研制和疫苗的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料 HCMV AD169病毒株(中国疾病预防控制中心病毒病所)，人胚肺成纤维(Human embryo lung，HEL)细胞、E.coli TOP10 菌株、PET30a(+)载体及BL21(DE3)菌株(均为本实验室保存);pMD18-T载体、限制性内切酶(大连宝生物工程公司)，1640培养基(GIBCO 公司)，D2000 DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)，DNA提取试剂盒、Taq酶、质粒纯化试剂盒及DNA凝胶电泳回收试剂盒［天根生化科技(北京)有限公司］;其他试剂均为进口或国产分析纯产品。

1.2 目的基因选择及引物设计 查阅Genbank中HCMV AD169株pp65基因序列，选961～1 686 bp的片段321aa-562aa设计引物，在上游引物5'端引入NdeⅠ酶切位点(CATATG)，下游引物5'端引入XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)，序列如下:P1(上游):5'-GGGAATTCCATATGATGAACGGGCAGCAGATCT-3'，P2(下 游):5'-CCGCTCGAGTCAACCTCGGTGCTTTTTGG-3'，引物由北京博尚生物技术有限公司合成。

1.3 HCMV DNA提取及目的基因扩增 常规培养HEL细胞，待细胞生长成单层后以感染复数量(M.O.I)＞5的HCMV接种细胞，待细胞病变达90%时收获。弃培养上清，DNA提取试剂盒提取DNA并以其为模板扩增目的基因。PCR反应体系为25 μL，反应条件为94 ℃预变性3 min，94 ℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 1 min，30个循环;72℃延伸10 min。取扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，DNA凝胶电泳回收试剂盒回收目的带。

1.4 表达载体pET30a(+)-pp65构建 将回收片段连接于pMD18-T载体，转化TOP10感受态菌株，提取质粒做NdeⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定并委托北京博尚生物技术有限公司测序。将片段与经相同双酶切的pET30a(+)质粒连接、转化BL21(DE3)感受态菌株。用PCR方法进行鉴定。

1.5 目的蛋白表达及纯化 挑取PCR鉴定阳性菌落接种于5 mL K+LB培养液中，37℃剧烈震荡培养16 h，以1∶100转接于新鲜K+LB培养液中，37℃剧烈震荡培养至A600约为0.8，加入终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)继续37℃剧烈震荡培养4 h，取1 mL菌液，4 000 r/min离心10 min收集菌体，加入去离子水和2×SDS蛋白凝胶加样缓冲液各100 μL重悬，煮沸10 min，12 000r/min离心10 min;取上清液20 μL与蛋白Marker同时行十二烷基硫酸钠—聚丙稀酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，考马斯亮蓝R250染色，脱色液脱色后观察有无目的条带。常规镍柱法纯化目的蛋白，SDS-PAGE电泳观察蛋白纯度，BCA法测定蛋白浓度。

1.6 目的蛋白纯化及抗原性检测 采用ELISA法。将纯化的pp65蛋白用包被液稀释，按25 ng/孔分别加入聚苯乙烯板孔中，同时包被全病毒抗原，饱和湿度4℃过夜;次日以20%山羊血清封闭，加入1∶100稀释的HCMV阳性血清，同时做空白、阴性对照，37℃孵育1 h;洗净甩干后加入1∶500稀释的羊抗人IgM-HRP，37℃孵育1 h;洗净甩干后加入TMB显色液0.1 mL/孔，37 ℃10 min，加入终止液(2M H2SO4)0.1 mL，以空白对照孔调零后采用酶标仪测各孔A450，P/N≥2.1即为阳性(P代表试验孔A值，N代表阴性对照孔A值)。

2 结果

2.1 目的基因扩增 PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后在726 bp处获得特异性条带，与预期目的基因大小一致(图1)。测序结果与目的基因序列符合率达99%，其中第13位C突变为A，氨基酸由Gln突变为Lys，第52位G突变为A，氨基酸由Glu突变为Lys。经蛋白质分析软件分析，突变氨基酸处于蛋白质空间结构的内部，不影响其抗原性及亲水性。

图1 HCMV pp65的PCR产物

2.2 表达载体pET30a(+)-pp65的构建与鉴定重组质粒pET30a(+)-pp65经双酶切、凝胶电泳后，在726、5 422 bp获得电泳带，大小与目的基因及载体片段长度一致(图2)。

2.3 目的蛋白表达 SDS-PAGE电泳结果显示，含重组质粒的诱导菌在相对分子质量约为30 kD处出现一强蛋白条带，而空载体菌在相应位置未出现该蛋白条带(图3)。

图2 pET30a(+)-pp65酶切图谱

图3 目的蛋白SDS-PAGE电泳结果

2.4 目的蛋白抗原性 pp65抗原和全病毒抗原的P/N 值分别为 2.737、2.535，证明表达的截短 pp65蛋白抗原性优于全病毒抗原。

3 讨论

机体初次感染HCMV后可受到宿主免疫控制，故大多数表现为临床不显性感染或潜伏感染，且伴随终身。当机体免疫功能受损时，潜伏的病毒被激活、增殖可导致严重感染。HCMV由母婴传播可致新生儿神经发育迟缓和其他先天性缺陷。因此对HCMV感染的早期诊断、预防和治疗是众多研究者关注的热点。

pp65为HCMV的主要被膜磷蛋白，占被膜蛋白致密颗粒的95%，占整个病毒蛋白的15%。在HCMV AD169株的标准序列中，其编码基因UL83位于119，352 ～121，037(互补链)，全长 1 686 bp，编码561氨基酸。在不同的HCMV病毒株中，pp65具有高度的保守性，抗原决定簇变异较少［7］，主要参与病毒基因调节以及改变宿主细胞的代谢。

研究表明，pp65蛋白或其短肽段在体内外均可诱导特异性细胞免疫应答［8］，而后者是显示HCMV活动性感染的一项重要早期指标之一，对区分HCMV感染呈激活还是潜伏状态有重要价值。因pp65刺激产生细胞免疫的能力较强，已成为目前用于制备疫苗的首选靶抗原。Beckman公司的科研人员构建了包含HCMVpp65抗原表位的嵌合型融合肽段，在HLA-A*0201/κ(b)转基因小鼠试验中激发了强烈的CTL应答［9］。因而，本研究选择HCMV AD169株pp65基因序列中抗原性强及特异性高的亲水性片段(321aa-562aa)为研究对象，结果显示PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后在726 bp处获得特异性条带，与预期目的基因大小一致;重组质粒pET30a(+)-pp65经双酶切、凝胶电泳后，在726、5 422 bp获得电泳带，大小与目的基因及载体片段长度一致;含重组质粒的诱导菌在相对分子质量约为30 kD处出现一强蛋白条带，而空载体菌在相应位置未出现该蛋白条带;pp65抗原和全病毒抗原的P/N 值分别为 2.737、2.535。

综上所述，本研究成功表达截短HCMV pp65抗原，并证实其蛋白抗原性优于全病毒抗原;此为HCMV检测试剂盒的研制和疫苗的研究提供了依据。

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