体外MPP+诱导胚胎大鼠中脑多巴胺能神经元模型的建立

龚超超，郎 娟，熊中奎

(1绍兴文理学院医学院临床医学部，浙江绍兴 312000;2杭州师范大学基础医学部)

帕金森病(Parkinson＇s disease，PD)是一种常见的年龄相关性、神经退行性、运动障碍性疾病，60岁以上人群中发病率为1%～2%。原发性PD的特征性变化是黑质致密区多巴胺(Dopamine，DA)能神经元变性丢失和路易体(Lewy body，LB)形成。作为一种缓慢进展的疾病，PD严重影响患者的运动功能和生活能力，给患者本人、家庭以及社会带来沉重负担。伴随我国老龄人口所占比重的逐步提高，PD引起越来越多的医药科研人员的重视，而建立一个稳定可靠的DA能神经元模型对发病机制研究及新治疗方法探索都显得尤为必要。2008年1～12月，我 们采用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶离子(MPP+)体外诱导胚胎大鼠建立中脑DA能神经元模型，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 妊娠14～15 d的SD大鼠(上海斯莱克实验动物有限公司);主要试剂包括 DMEM/F12、B27与马血清(Gibco公司)，MPP+(Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，胰蛋白酶(华美生物工程公司)，青霉素、链霉素(上海新先锋药业有限公司)，抗酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)兔多克隆抗体(Chemicon公司)，抗兔第二抗体与SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，其他试剂均为市售分析纯;主要仪器包括恒温CO2培养箱(美国Heraeus公司)，HimacCR-21 F型高速冷冻离心机(日本Hitahi公司)，UV2000分光光度计(日本Hitachi公司)，DXM1200型倒置显微镜(日本Nikon公司)。

1.2 中脑DA能神经元培养［1，2］将妊娠14～15 d的SD大鼠用无水乙醚在密闭空间中麻醉，采用无菌操作方式取出胚胎中脑腹侧部分组织，以含0.125%胰酶的D-Hanks溶液消化5 min，吸弃部分胰酶消化液，加入含血清DMEM/F12培养基(过滤除菌的DMEM/F12培养基中添加10%胎牛血清、5%马血清、50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素)终止反应，轻轻吹打使之成细胞悬液，200目筛过滤;滤液经1 000 rpm离心5 min收集细胞，以含血清DMEM/F12培养基重悬细胞沉淀，按照1×105/cm2的密度接种到预先经多聚赖氨酸包被的BD FalconTM 96孔细胞培养板中，置于37℃含饱和蒸汽、5%CO2的培养箱，3 d后换成含1%B27的无血清DMEM/F12培养基(过滤除菌的DMEM/F12培养基中添加50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素，临用前加入1%B27)，以后每3～4 d换液一次。体外培养7 d后进行后续实验。

1.3 MPP+诱导PD细胞模型的制备 将1.2培养的细胞随机分为实验组和对照组，每组分别有3个复孔。实验组加入MPP+(以含1%B27的无血清DMEM/F12培养基配制)至终浓度为10 μmol/L进行诱导，对照组加入等量含1%B27的无血清DMEM/F12培养基，均继续培养48 h，进行后续实验。该实验独立重复6次。

1.4 TH阳性神经元数量和突起长度测定 采用免疫细胞化学染色法。取1.3中培养的细胞弃去细胞培养孔中培养基，PBS洗5 min×3次;4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗5 min×3次。3%H2O2室温孵育15 min，PBS洗5 min×3次;0.3%Triton-X-100溶液孵育30 min，PBS洗5 min×3次;5%牛血清白蛋白封闭液室温下封闭20 min;TH第一抗体(兔抗小鼠，1∶1 000)37 ℃孵育4 h，PBS洗5 min×3次;抗兔第二抗体(1∶3)37 ℃孵育0.5 h，PBS洗5 min×3次;SABC孵育室温30 min，PBS洗 5 min×3次;DAB显色，PBS终止反应。Nikon倒置显微镜下观察，每个培养孔在100倍和200倍放大视野下分别拍摄10张图片，100倍视野下计数TH阳性神经元数量，200倍视野下测量每个TH阳性神经元最长突起的长度。

1.5 统计学方法 采用SAS6.12软件进行统计学处理。计量数据用±s表示，采用配对设计Student'st检验，P≤0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TH阳性神经元数量 在放大倍数(×100)视野下，实验组和对照组中脑TH阳性神经元数量分别为(351.5 ± 32.7)、(538.0 ± 58.7)个，前者较后者降低了34.7%(P＜0.01)。见图1A、B。

2.2 TH阳性神经元突起长度 在放大倍数(×200)视野下，实验组和对照组中脑TH阳性神经元突起长度分别为(121.6 ±6.1)、(246.9 ±11.3)μm，前者较后者缩短了 50.7%(P＜0.001)。见图1C、D。

图1 TH阳性神经元免疫组化染色

3 讨论

MPP+、6-羟基多巴(6-OHDA)、鱼藤酮和百草枯等神经毒素均可通过诱导体外培养细胞制备PD细胞模型，但其作用机制不尽相同。其中6-OHDA可通过直接或间接促活性氧生成，抑制线粒体氧化呼吸链的途径诱导DA能神经元死亡。鱼藤酮是一种亲脂性杀虫剂，可抑制脑组织线粒体复合体I的活性，选择性损伤DA能神经元并伴有LB样包涵体形成［3］。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)本身不具有毒性，其可被胶质细胞摄取并转化为MPP+后释放到胞外，然后被DA能神经元摄取后抑制其线粒体复合体I导致ATP生成减少。另有研究发现，MPP+可通过激活Caspase和蛋白激酶C影响快速轴浆运输(Fast axonal transport，FAT)并导致突触功能失常，从而产生逆向性死亡(Dying-back)的病理过程［4，5］。百草枯的化学结构类似于 MPP+，其毒性可能是由超氧自由基形成介导的。

研究证实，MPP+可诱导多种体外培养细胞［包括大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)、人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)及原代培养胚胎大(小)鼠中脑DA能神经元等］产生神经毒性作用。尽管PC12和SH-SY5Y在某些功能上近似于DA能神经元，但因两者为肿瘤细胞来源，许多生物学特性与DA能神经元明显不同。胚胎小鼠(孕13～15 d)中脑DA能神经元的原代培养并不十分常见，因为与胚胎大鼠中脑DA能神经元的原代培养相比，其手术操作过程要求更加精细，难度更大［6］。本实验所采用胚胎大鼠(孕14～15 d)脑体积明显超过胚胎小鼠(孕13～15 d)，取材操作难度相对较小，而且能获得更多中脑细胞。本研究结果显示，在放大倍数(×100)视野下，实验组中脑TH阳性神经元数量显著低于对照组;在放大倍数(×200)视野下，实验组中脑TH阳性神经元突起长度显著短于对照组。提示MPP+损伤可导致离体胚胎大鼠中脑TH阳性神经元神经元数量显著减少、突起长度显著缩短，尤以对突起长度的损伤作用更加明显。

综上所述，MPP+体外诱导可成功建立胚胎大鼠中脑DA能神经元模型，此为PD发病机制和药物干预研究奠定了基础。

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