骨肉瘤组织中Skp2、p27蛋白的表达变化及意义

(河北医科大学第四医院，石家庄 050011)

Skp2是细胞增殖的重要调控蛋白，研究发现Skp2表达与大多数恶性肿瘤的发生、进展、转移及预后有密切关系。p27为一种参与细胞周期调控的重要抑癌基因，其通过调控活化细胞周期素依赖性激酶-2所需的细胞周期素E的阈值来抑制细胞增殖。研究发现［1］，Skp2和p27蛋白在恶性肿瘤组织中的表达呈负相关，两者从相反方面调控细胞周期素激酶活性。2008年6月～2011年6月，本研究采用免疫组化SP法检测了人骨肉瘤组织及正常骨组织中的Skp2和p27蛋白，探讨两者在骨肉瘤中的表达特点及意义。

1 材料与方法

1.1 材料 骨肉瘤组40例均为河北医科大学第四医院手术切除并病理存档的骨肉瘤石蜡标本。患者中男27例，女13例，年龄11～39岁，平均21岁。其中成骨肉瘤30例，软骨肉瘤10例;低分化16例，高分化24例;有淋巴结转移17例，无淋巴结转移23例。所有病例术前均未接受放化疗。另选40例正常骨组织为对照组，均来源于手术治疗的骨折患者，患者中男30例，女10例，年龄13～42岁，平均23岁。两组患者性别、年龄相比，P均＞0.05。

1.2 主要试剂 鼠抗人Skp2和p27单克隆抗体，免疫组化染色试剂盒(SP盒)及DAB-HCL显色试剂盒。

1.3 Skp2和p27蛋白的检测 采用免疫组化SP法。每例石蜡标本以4 μm切片，常规脱蜡，微波修复抗原，3%H2O2处理10 min以抑制内源性过氧化物酶活性。正常羊血清处理15 min，一抗4℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理15 min，链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶复合物处理15 min，DAB显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作阴性对照，用已知免疫组化阳性切片作阳性对照。

1.4 结果判定 以胞质内出现明显棕黄色颗粒者为Skp2和p27蛋白表达阳性细胞，显微镜下(×40)观察，每片选8个不重复的高倍视野，计算阳性细胞占细胞总数的百分比，取其均值。以阳性细胞百分比≥25%为Skp2、p27蛋白表达阳性、＜25%为阴性。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件。计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验。采用四格表法进行相关性分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤组与对照组Skp2、p27蛋白表达比较骨肉瘤组中Skp2蛋白表达阳性27例，p27蛋白阳性12例，对照组中分别为13、25例，两组相比，P均＜0.05。

2.2 Skp2、p27蛋白表达与骨肉瘤临床病理参数的关系 Skp2蛋白表达与骨肉瘤组织类型、分化程度、淋巴结转移有关(P均＜0.05);p27蛋白表达与骨肉瘤组织类型、分化程度有关(P均＜0.05)，与淋巴结转移无关(P＞0.05)。详见表1。

2.3 骨肉瘤组织中Skp2、p27蛋白表达的相关性骨肉瘤组织Skp2蛋白表达阳性的27例中，有p27蛋白阳性12例(阳性符合率为44.4%);Skp2蛋白表达阴性13例中，有p27蛋白阴性2例(阴性符合率为15.4%)，Skp2、p27蛋白在骨肉瘤组织中的表达呈负相关关系(r= －0.34，P＜0.05)。

3 讨论

Skp2是一种F-box蛋白，有四个亚单位，是调节细胞周期G1/S期过渡的关键。Skp2的过度表达可以促进肿瘤的发生、侵袭和转移，而缺乏则可对肿瘤起到抑制作用［2］。Skp2通过G/S转换“关卡”促进细胞周期的进展［3］，从而促进DNA的复制、细胞增殖，因此Skp2基因被认为是一种原癌基因，具有癌基因功能。Skp2应用于人类肿瘤检测时，是不良预后的标志之一。其作为F-box蛋白成员之一，在人感细胞生长因子(SCF)复合体中能够特异识别蛋白底物，降低细胞周期蛋白p27、p21等的表达，使S期细胞增加，抗凋亡能力增强［4］。有学者研究发现，Skp2阳性表达者与阴性表达者相比，恶性肿瘤进展更快，更易发生转移和复发，并且预后差，因此认为Skp2可作为评估恶性肿瘤预后的重要生物学标记［5］。本研究结果也显示，Skp2在骨肉瘤组织中的阳性表达率较正常骨组织明显升高。

表1 Skp2、p27蛋白表达与骨肉瘤临床病理参数的关系

Skp2可通过泛素化或者降解底物如p27来调节细胞周期和细胞增殖［5］。研究表明，Skp2在肿瘤的移行、侵袭和转移中起到直接作用［6］。Skp2在单独缺乏时不会诱导细胞凋亡，但联合缺乏肿瘤抑制蛋白(ARF)或磷酸酶抑癌基因(PTEN)时可以诱导细胞凋亡［7］。Skp2缺乏者肿瘤细胞转移会受到严重影响，而Skp2高表达则可大大促进细胞的移行和转移。RAS基因同源基因A家族(RhoA)与肿瘤细胞的转移有关。在Skp2缺乏的细胞，RhoA mRNA及蛋白水平都会极大降低，而在Skp2过度表达时RhoA mRNA及蛋白水平会相应增加［8］，提示Skp2抑制细胞转移可能是通过RhoA来实现的。本研究中，40例骨肉瘤患者中有27例Skp2表达阳性，且其在成骨肉瘤、有淋巴结转移者、低分化者中的阳性表达率分别高于软骨肉瘤、无淋巴结转移者、高分化者，表明Skp2阳性表达者肿瘤恶性程度高、进展快，易发生转移和复发并且预后差，与相关研究结果一致。

p27是一种广谱的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白［9］。作为一种参与细胞周期调控的重要抑癌基因，它直接参与细胞的生长抑制、分化等调控过程，其表达下调会导致细胞周期调控紊乱［10］。p27与细胞的分化有关，过度表达抑制细胞的分裂，表达不足促进肿瘤的发生［11］。研究表明，p27很少或不发生基因突变，对细胞周期的调控主要通过其蛋白的表达水平及活性改变。在多种肿瘤中可发现p27表达下降，如胃癌、乳腺癌、前列腺癌和非小细胞肺癌。p27能通过抑制依赖细胞周期素激酶(如cdk-1、cdk-2和cdk-4/6)，抑制G0/G1的转变，从而抑制细胞增殖［12］。有学者研究发现，部分恶性肿瘤组织中p27蛋白及其mRNA呈阴性表达，而其相应正常组织及良性病变组织中p27多呈阳性表达，这说明p27高表达有助于抑制肿瘤的发生，低水平的p27与恶性肿瘤转移和不良预后相关［13］。本研究40例骨肉瘤患者中有12例p27表达为阳性，且其在恶性程度较低的软骨肉瘤及高分化者中表达阳性率更高，证实了上述观点。

大量研究表明Skp2与p27蛋白表达水平呈负相关关系［14］，Skp2能够降低p27蛋白表达，促使细胞由G1期进入S期，抗细胞凋亡能力增强，同时促进细胞的增殖，导致肿瘤的发生。本研究发现，Skp2蛋白表达阳性者中有p27蛋白阳性12例(阳性符合率为44.4%)，Skp2蛋白阴性者中有p27蛋白阴性2例(阴性符合率为15.4%)，Skp2、p27蛋白在骨肉瘤组织中的表达呈负相关关系(r=－0.34，P＜0.05)，与国内外研究结果一致，提示Skp2—p27可能代表了一种致癌通路。由于Skp2在多种肿瘤组织中表达增高，针对Skp2的靶向治疗将给许多肿瘤患者带来希望［15］。近年来多项动物实验显示，应用Skp2拮抗剂能使肿瘤细胞凋亡、产生自噬、衰老等［16，17］。而p27在恶性肿瘤中低表达，抑制肿瘤细胞增殖，提示针对Skp2和p27的靶向治疗应该是有效的。抑制或者敲除Skp2基因以提高p27蛋白的表达率，可抑制G1/S期的转换，从而抑制恶性肿瘤的进展，已经在一些恶性肿瘤的治疗中得到了证实。因此，检测Skp2和p27蛋白的表达对骨肉瘤患者肿瘤恶性程度的判断、治疗及预后具有重要意义。

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