两种关键信号转导通路活性状态与K562细胞对DNR、Ara-C敏感性的关系

(广州医学院第一附属医院，广州 510120)

近年来研究发现，白血病存在Ras/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶人第10染色体缺失磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)/蛋白激酶(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶体蛋白(mTOR)和(或)Ras/Raf/细胞外信号调节酶(MEK)/丝裂原活化蛋白激酶(ERK)等关键信号转导通路的异常［1，2］。磷酸化蛋白如 p-Akt和 p-ERK1/2 的激活，会使肿瘤细胞增殖潜能、逃避凋亡和免疫杀伤的能力增强，肿瘤细胞增殖失控，对诱导凋亡的药物敏感性下降并导致耐药性产生［3，4］。这些信号转导通路的磷酸化蛋白有望作为分子靶向治疗的位点之一。2011年10～12月，本研究对粒细胞白血病细胞株K562采用通路靶点抑制剂U0126(MEK抑制剂)、LY294002(PI3K抑制剂)和雷帕霉素(mTOR抑制剂)以及激活剂佛波酯(PMA，ERK激活剂)进行处理，观察两种关键信号通路的活性状态与K562细胞对柔红霉素(DNR)和阿糖胞苷(Ara-C)敏感性的关系。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 RPMI1640和胎牛血清购自美国Gibco公司;细胞固定液(含16%甲醛)、细胞破膜液Ⅲ(含90%甲醇)、Stain Buffer、Annexin Ⅴ/PI凋亡试剂盒购自美国Becton Dickinson公司;IGG1鼠抗人单克隆抗体、p-Akt T308-PE、p-Akt S473-Alexa 647、p-ERK1/2-Alexa 488购自美国Becton Dickinson公司;U0126、LY295002、雷帕霉素、佛波酯(PMA)购自美国Sigma公司;柔红霉素购自深圳万乐公司;阿糖胞苷购自哈尔滨莱博通公司;K562由广州医学院附属肿瘤医院生物工程室馈赠。

1.2 细胞培养及分组 将K562置于含有15%胎牛血清(FPS)的RPMI1640培养液中，在37℃、含5%CO2、饱和湿度的恒温孵育箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。用含有10%FPS的RPMI1640重悬K562细胞，使细胞密度达到(1～5)×106/mL。将细胞分为5个组，经U0126、LY294002、雷帕霉素处理的细胞分别为抑制剂A、B、C组，经PMA刺激的细胞为激活剂组，未作处理者为对照组。

1.3 K562中磷酸化蛋白的检测 细胞内磷酸化蛋白抗体标记:IGG1阴性对照管为IGG1-Alexa 488/IGG1-PE/IGG1-Alexa 647;磷酸化抗体标记管为p-ERK1/2-Alexa 488/p-Akt T308-PE/p-Akt S473-Alexa 647。根据所标记单抗使用要求，K562分别予固定、破膜处理后［1］，加入上述单抗进行胞内磷酸化信号蛋白的标记。采用磷酸化流式细胞术检测K562中的 p-ERK1/2、p-Akt T308 和 p-Akt S473。

1.4 细胞凋亡检测 将5组细胞分别加入DNR、Ara-C，对照组不加药。细胞于37℃、5%CO2环境中孵育48 h。采用AnnexinⅤ/PI标记法检测细胞凋亡率。取细胞密度为(1～5)×106/mL的细胞悬液1 mL，分别加入AnnexinⅤ和PI，混匀，室温避光孵育15 min。加入Wash Buffer上流式细胞仪检测。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量数据以±s表示，组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组K562中磷酸化蛋白的表达变化 见表1。

表1 各组K562中磷酸化蛋白的表达变化(%，±s)

表1 各组K562中磷酸化蛋白的表达变化(%，±s)

注:与对照组相比，*P ＜0.05

组别p-Akt T308 p-Akt S473 p-ERK1/2对照组83.24 ±14.29 51.82 ±1.32 54.55 ±30.56激活剂组 94.70 ± 3.53 72.55 ±5.44* 97.85 ± 3.07*抑制剂 A 组 87.35 ± 0.07 52.55 ±5.44 6.75 ± 0.50*抑制剂 B 组 57.60 ± 0.74* 17.00 ±0.29* 18.25 ± 1.48*抑制剂C组81.24 ±11.19 50.98 ±0.41 52.95 ±26.76

2.2 Ara-C和DNR作用后各组K562细胞凋亡率比较 见表2。

表2 Ara-C和DNR作用后各组K562细胞凋亡率比较(%，±s)

表2 Ara-C和DNR作用后各组K562细胞凋亡率比较(%，±s)

注:与对照组相比，*P ＜0.05

组别 K562细胞凋亡率Ara-C作用后 DNR 作用后对照组65.15 ±0.21 58.50 ±0.57激活剂组 48.10 ±2.83* 23.40 ±2.78*抑制剂 A 组 63.80 ±0.15 89.70 ±3.12*抑制剂 B 组 72.60 ±2.07* 79.70 ±1.26*抑制剂 C 组 82.50 ±0.33* 88.60 ±2.04*

3 讨论

Ras/PI3K/Akt/mTOR是标准的生存通路，在白血病等多种恶性肿瘤中被激活。其初级效应分子Akt激活后转入核内磷酸化一系列胞内底物，这些底物参与调控细胞凋亡、细胞周期进程、转录和转化［5］。实验证明，与没有Akt激活的细胞相比，存在Akt活化的细胞株在化疗药物的作用下增殖力和集落生成能力增强［6］。研究表明，Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR通路活化与多种肿瘤发生耐药有关，而阻断Ras/PI3K/Akt/mTOR的磷酸化蛋白表达能快速诱导细胞凋亡，尤其适用于肿瘤的联合治疗［7］。ERKs位于一系列受体的下游，活化转入核内磷酸化其他转录因子［8，9］，主要通过下调肿瘤细胞对药物的敏感性从而产生耐药。抑制Ras/Raf/MEK/ERK通路中的Raf和MEK能提高白血病的化疗效果，纠正耐药、改善患者生存质量［10］。

PMA是K562中 p-ERK1/2的强效激活剂［10］。在本研究中，K562经PMA刺激10 min后p-ERK1/2阳性表达明显增强。由于Ras/Raf/MEK/ERK和Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR信号通路能通过通路间的共同位点(如FLT3-ITD、Ras、CREB等)发生相互作用［10］，所以 K562 中 p-Akt T308、p-Akt S473 的表达也有不同程度的升高。通路激活增强后，DNR、Ara-C所诱导的 K562凋亡减少，提示 Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路与肿瘤细胞抗凋亡、耐药有关，与文献［6］报道一致。

U0126是Ras/Raf/MEK/ERK通路中MEK的抑制剂，能阻止下游的ERKs将膜表面信号转录到胞内，从而阻断通路活化［10］。本研究中，抑制剂A组中p-ERK1/2表达下降，DNR诱导的K562凋亡率与对照组相比明显增加，但Ara-C诱导的K562细胞凋亡率与对照组相近。LY294002是PI3K的抑制剂，能通过级联反应特异性抑制Akt的磷酸化［11］。我们采用LY294002作用K562后，细胞中p-Akt表达明显降低，证明LY294002可以抑制p-Akt表达。DNR和Ara-C作用于抑制剂B组后，细胞凋亡率均较对照组明显增加。雷帕霉素是mTOR抑制剂，它通过与FK506连接蛋白FKBP-12相结合，抑制下游转录因子作用的同时能反向抑制Akt，从而抑制因Ras/PI3K/PTEN/AKT/mTOR通路的异常激活［12，13］。但由于雷帕霉素是作用于 Akt下游的mTOR，所以本研究中我们未能检测到p-Akt表达的下降。DNR和Ara-C分别作用后，抑制剂C组K562凋亡率较对照组均有所升高。上述结果说明，联用Ras/PI3K/PTEN/AKT/mTOR通路抑制剂能增强白血病细胞对DNR和Ara-C的敏感性，抑制Ras/Raf/MEK/ERK通路能增强DNR的抗肿瘤效应，但对Ara-C诱导的细胞凋亡的作用不明显。

有学者发现，抑制Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路能提高ADM和紫杉醇等药物对伴有信号转导通路异常激活的肿瘤的治疗效果［6］。本研究中DNR作用后抑制剂A、B组的细胞凋亡率均较对照组增加，说明抑制 Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路能增强K562对DNR的敏感性。联用Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR通路抑制剂也增强了Ara-C的抗肿瘤效应。提示Ras/PI3K/PTEN/AKT/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路激活与肿瘤对蒽环类药物耐药的产生有关，联用通路抑制剂不仅能纠正耐药，还可降低化疗药使用剂量，从而减少化疗相关不良反应。但在本研究中，抑制K562Ras/Raf/MEK/ERK通路未能提高Ara-C的抗肿瘤效应。这可能与K562对信号转导通路抑制剂的敏感性有差异有关。

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