应用流式细胞仪进行CHO细胞计数及存活率计算

高 茜，管 莹，米其利，李雪梅，缪明明，夭建华

(云南烟草科学研究院,云南 昆明 650106)

中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO cell)因其生长快、易培养等特性，被广泛应用于生物工程和多种化学物质的毒理学评价[1～3]。对于CHO工程细胞的悬浮培养而言，细胞密度与存活率是影响细胞生长和细胞表达产物的重要因素之一[4，5]；而在毒理学评价实验如中性红细胞毒性实验中，接种的细胞密度对实验定量结果也有较大的影响[6]。因此，在大规模的细胞实验中需要快速准确地进行细胞计数及细胞存活率计算。

传统的血球计数板法易受操作细节影响，精确性得不到保证，并且费时费力。流式细胞仪法由于具有快速定量的特点，近年来在多种生物学实验如细胞周期测定、细胞凋亡检测、细胞分选中都得到应用，但流式细胞仪在细胞计数方面的应用主要是定性地分辨血液细胞中不同标记的细胞比例[7，8]，而对CHO工程细胞的定量细胞计数却未见报道。作者在此应用流式细胞仪进行细胞计数及存活率计算，以期为CHO细胞的蛋白生产及化学品的毒理学评价提供依据。

1 实验

1.1 细胞、试剂与仪器

中国仓鼠卵巢细胞，中国科学院昆明细胞库。

DMEM/F12细胞培养液、PBS、胎牛血清，美国Giboco公司；胰蛋白酶，美国Invitrogen公司；PI(碘化丙啶染色剂)，美国Sigma公司；台盼蓝，上海索来宝公司。

流式细胞仪(Cell Lab Quanta SC High Resolution Flow Cytometry)、流式管，Beckman Coulter公司；CO2培养箱，Thermo公司；二级生物安全柜，Heal Force公司；TS100-F-HMC型倒置显微镜，Nikon公司；细胞培养瓶，美国Corning公司；XS204型分析天平(感量0.0001 g)，Mettler Toledo公司；DT5-5型离心机，北京时代北利离心机有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CHO细胞的培养及处理

在37 ℃水浴中复苏CHO细胞，之后接种到细胞培养瓶中。用DMEM/F12细胞培养液(含10%胎牛血清)在5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养。待细胞汇合率达到80%，用胰蛋白酶消化细胞为单细胞悬液，用PBS洗涤并离心后进行细胞计数。部分细胞用70%乙醇固定30 min，再用PBS洗涤后进行细胞计数。

1.2.2 应用流式细胞仪进行细胞计数与细胞存活率计算

用移液枪将500 μL细胞悬液移至流式管中，加入5 μL 1 mg·mL-1PI，轻轻吹打均匀后避光染色5～10 min，放入流式细胞仪进样位置。打开流式细胞仪，第一次计数时选择Counting程序，根据实际情况调节电子体积(EV)及侧向散射光(SS)的值使细胞群位于合适的位置，并分别调节EV图及SS图中Counting的范围去除碎片干扰，再根据PI的荧光强度(FL3)设定死活细胞范围，并保存程序为CHO cell counting。以后计数时选择CHO cell counting程序来读取数据。细胞计数为SS图的统计值，细胞存活率为FL3图的统计值。

1.2.3 应用血球计数板进行细胞计数与细胞存活率计算

将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。用移液枪将50 μL细胞悬液移至离心管中，加入50 μL 0.1%台盼蓝染液，染色3 min后将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入。将血球计数板置于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的4个大格(每个大格含有16个中格)中的细胞数及被染液染上色的细胞数。按下式计算细胞悬液的细胞浓度及细胞存活率：

2 结果与讨论

2.1 建立流式细胞仪进行CHO细胞计数与细胞存活率计算的方法

流式细胞仪是根据EV和SS2个参数来识别CHO细胞的，由于不同细胞的大小和性质不同，要根据不同的细胞调整EV与SS的Gain值以使细胞易于分析。设置EV=0.16、SS=3.6，CHO细胞经流式细胞仪检测后得到的流式散点图如图1所示。

图1 流式细胞仪检测CHO细胞散点图(SS/EV)

由图1可以看出，消化的CHO细胞分散状况良好，大部分都是单细胞状态。

由于细胞在消化处理的过程中会受到一定的损伤，并且存在一些未消化完全的细胞团，为了排除这些因素的影响，分别设定SS及EV2个参数的范围以更精确地进行细胞计数。通过SS参数和EV参数去除细胞碎片、细胞团及细胞悬液中的杂质的直方图见图2。

图2 CHO单细胞范围直方图

PI(碘化丙啶)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但能够透过死细胞和凋亡细胞的细胞膜，在488 nm激发光下使细胞核红染[9]。因此，可用PI作为计算细胞存活率的染料，荧光强度低的为活细胞，荧光强度高的为死细胞。CHO细胞的PI着色直方图见图3。

图3 未处理(a)和70%乙醇处理(b)CHO细胞的PI着色直方图

由图3可以看出，未处理CHO细胞的PI着色图的峰值范围主要在100～102荧光范围内；70%乙醇处理后的CHO细胞的PI着色图的峰值范围主要在103～104荧光范围内。因此，可根据这两个区域分别划定活细胞及死细胞的范围从而计算细胞存活率。

2.2 两种方法细胞计数结果比较

用流式细胞仪和血球计数板分别对CHO细胞进行计数，每种计数方法计数3次并计算均值与SD值，结果见表1。

表1 流式细胞仪法与血球计数板法计算的细胞浓度

由表1可看出，流式细胞仪法计算结果与CHO细胞稀释梯度一致，并且SD值较低，重复性好；血球计数板法计算结果虽然也有一定的梯度，但与细胞稀释梯度并不完全吻合，SD值也较高，计算结果重复性较差，需要多次计数才能获得比较准确的结果。

为了进一步研究流式细胞仪法是否能替代血球计数板法进行细胞浓度计算，对两种方法的相关性进行分析，结果见图4。

图4 流式细胞仪法与血球计数板法计算的细胞浓度相关性分析

由图4可以看出，两种方法的相关系数R2=0.9341，表明相关性较好。

2.3 两种方法细胞存活率计算结果比较

用流式细胞仪和血球计数板分别对CHO细胞进行存活率计算，每种方法计算3次并计算均值与SD值，结果见表2。

表2 流式细胞仪法与血球计数板法计算的细胞存活率

由表2可以看出，流式细胞仪法计算的存活率结果与CHO细胞处理方式一致，并且SD值较低，重复性好；血球计数板法计算结果虽然也与CHO细胞处理方式基本吻合，但SD值较高，重复性较差，需要多次分析才能获得比较准确的结果。

为了进一步研究流式细胞仪法是否能替代血球计数板法进行细胞存活率计算，对两种方法的相关性进行分析，结果见图5。

图5 流式细胞仪法与血球计数板法计算的细胞存活率相关性分析

由图5可以看出，两种方法的相关系数R2=0.971，表明相关性很好。

3 结论

(1)应用流式细胞仪进行细胞计数和存活率计算的关键为SS值限制、EV值限制、FL3范围划定3个步骤。通过SS值限制和EV值限制计算细胞浓度，通过FL3范围划定计算细胞存活率。

(2)应用流式细胞仪计算的细胞浓度及细胞存活率数据准确可靠，重复性好，具有快速稳定的特点。因此，在大规模的细胞实验中，可以用流式细胞仪法替代血球计数板法对细胞状态进行分析。

参考文献：

[1] Johnson M D，Schilz J，Djordjevic M V，et al.Evaluation ofinvitroassays for assessing the toxicity of cigarette smoke and smokeless tobacco[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009，18(12):3263-3304.

[2] Jayapal K P，Wlaschin K F，Hu W S，et al.Recombinant protein therapeutics from CHO cells——20 years and counting[J].Chemical Engineering Progress，2007，103(10):40-47.

[3] 夭建华,陈辉敏,方力,等.国内外卷烟危害性评价方法现状和发展趋势[J].烟草科技,2007,(1):50-53.

[4] Wei Y Y，Naderi S，Meshram M，et al.Proteomics analysis of Chinese hamster ovary cells undergoing apoptosis during prolonged cultivation[J].Cytotechnology，2011，63(6):663-677.

[5] 高茜,管莹,曾婉俐,等.体外连续传代培养对生物工程细胞CHO凋亡的影响[J].化学与生物工程,2012，29(5):26-30.

[6] 管莹,夭建华,高茜,等.CHO细胞初始接种密度对细胞毒性试验结果的影响[J].化学与生物工程,2012，29(9)：39-42.

[7] 万岁桂,赵弘,徐娟,等.校正后的流式细胞术原始细胞计数在骨髓增生异常综合征分型诊断中的应用[J].内科急危重症杂志,2011,17(4):213-215.

[8] 万岁桂,赵弘,徐娟,等.流式细胞术CD34+细胞计数在骨髓增生异常综合症分型诊断中的作用[J].标记免疫分析与临床,2011,18(5):308-311.

[9] 陈必成,夏鹏,杨丽红,等.两种荧光染料——CFSE与碘化丙啶染色方法检测细胞杀伤能力[J].中华微生物学和免疫学杂志,2006,26(2):192.