絮凝菌MBF03发酵条件的优化

陈 俊，王 涛，陈 哲，武文丽，詹志钢

(武汉科技大学化学工程与技术学院，湖北 武汉 430081)

微生物絮凝剂(MBF)是利用微生物技术，通过发酵、提取、精制而得到的一类新型、高效、可降解的水处理剂[1]。MBF的分子量一般大于1×105，其主要成分包括糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素等[2]。虽然MBF有着传统无机和有机絮凝剂无可比拟的优势，但是由于产量低、生产成本高，制约了其工业化应用，目前仍处于实验室阶段。因此，优化MBF产生菌的发酵条件、提高生物絮凝剂产量、降低生产成本十分重要。为此，作者以高效絮凝菌MBF03为材料，探讨了碳源、氮源、初始pH值、培养时间、接种量和金属离子对絮凝剂产生及絮凝效果的影响，并对其絮凝活性分布进行了分析，拟为絮凝菌MBF03的应用奠定基础。

1 实验

1.1 菌种与培养基

絮凝菌MBF03，自行选育[3]并保藏。

GC培养基(g·L-1)[4]：葡萄糖12.0，酵母膏1.0，K2HPO41.0，KH2PO40.5，尿素0.5，NaCl 0.2，MgSO40.2，pH值6.5～7.3，115 ℃灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 发酵条件的优化

1.2.1.1 最适碳源的确定[5]

分别以等量的可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖、半乳糖、D-果糖代替GC培养基中的葡萄糖，30 ℃培养48 h后，测絮凝率。

1.2.1.2 最适氮源的确定[6]

分别以等量的硝酸钠、硝酸钾、蛋白胨、尿素、硝酸铵代替GC培养基中的酵母膏，30 ℃培养48 h后，测絮凝率。

1.2.1.3 最适初始pH值的确定[7]

调节培养基的初始pH值分别为3、4、5、6、7、8、9，30 ℃培养48 h后，测絮凝率。

1.2.1.4 最适培养时间的确定

分别培养6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h、72 h、78 h，测定pH值、絮凝率和细胞干重。

1.2.1.5 最适接种量的确定[8]

接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%，30 ℃培养48 h后，测絮凝率。

1.2.1.6 金属离子对絮凝效果的影响[9]

测定不同投加量的Ca2+和Mg2+对絮凝率的影响。

1.2.2 絮凝活性分布测定[10]

取10 mL发酵液于12 000 r·min-1离心20 min，收集上清液，并定容至10 mL，备用。分别测定发酵液、上清液和离心沉淀的絮凝率。

1.2.3 分析检测

絮凝率可采用高岭土法[8]和铝土矿粉法(用200目的铝土矿粉代替高岭土，其它步骤同高岭土法)测定；细胞干重分析参照文献[10]进行。

2 结果与讨论

2.1 碳源对絮凝效果的影响(图1)

图1 碳源对絮凝率的影响

由图1可以看出，以葡萄糖作为碳源，絮凝菌MBF03的絮凝率最高。这是因为，絮凝菌MBF03良好的絮凝活性主要是由其丰富的胞外多糖(经鉴定为胞外酸性多糖[3])赋予的，而以葡萄糖作为碳源有利于胞外多糖的合成[11]。因此，选择最适碳源为葡萄糖。

2.2 氮源对絮凝效果的影响(图2)

图2 氮源对絮凝率的影响

由图2可以看出，以无机氮源硝酸铵作为氮源，絮凝菌MBF03的絮凝率最高；而酵母膏等有机氮源虽营养丰富，但与无机氮源相比，微生物利用速度缓慢[12]，絮凝效果不是很好。因此，选择最适氮源为硝酸铵。

2.3 初始pH值对絮凝效果的影响(图3)

图3 初始pH值对絮凝率的影响

由图3可以看出，初始pH值为6时，絮凝菌MBF03的絮凝率最高。因此，选择最适初始pH值为6。

2.4 培养时间对菌体生长和絮凝效果的影响(图4)

图4 培养时间对菌体生长和絮凝效果的影响

由图4可以看出，絮凝菌MBF03的絮凝率在培养18 h时就达到85.91%，培养48 h时达到最高，为90%，之后缓慢下降，在78 h时仍有80.97%；细胞干重在培养24 h左右达到最大值，之后逐渐降低；菌液pH值在培养初期略有下降，但12 h后基本稳定在6左右。综合来看：细胞生长量在24 h时达到峰值，而絮凝率的峰值出现在48 h，表明并不是细胞量最多的时候絮凝率最高。这是因为，絮凝活性主要来自于胞外分泌物，从细胞量达到最多到胞外分泌物达到最多需要一定的时间，即有一个代谢延迟。由图4还可以看出，培养48～72 h，絮凝菌MBF03的絮凝率没有明显的下降，这说明MBF03菌所产的絮凝剂稳定性良好。

2.5 接种量对絮凝效果的影响(图5)

图5 接种量对絮凝率的影响

由图5可以看出，接种量过多或过少都会降低絮凝率，在接种量为4%时絮凝率达到最高。这是因为，接种量过多，发酵液中的菌很快达到生长平台期，细胞干重达到最大值，而细胞干重最大值与絮凝活性最大值(即胞外酸性多糖的最大值)之间存在时间延迟，所以如果很快达到生长平台期，是不利于胞外酸性多糖的分泌与累积的，从而导致絮凝率较低；而接种量过少，细胞达到生长平台期时间过长，导致反应体系中增殖代数过多的菌的老化，也不利于胞外酸性多糖的代谢与分泌，也会导致絮凝率较低。因此，选择最适接种量为4%。

2.6 金属离子对絮凝效果的影响

在100 mL悬浊液中分别投加不同量的1 g·L-1Mg2+溶液和Ca2+溶液，探讨金属离子对絮凝效果的影响，结果见图6。

图6 金属离子对絮凝率的影响

由图6可以看出，随着Ca2+、Mg2+投加量的增大，絮凝率先升高后降低。这是因为，适量的金属离子中和了颗粒物基团表面的负电荷，使不同颗粒容易聚合，从而加强了絮凝剂的絮凝效果；而过多金属阳离子的引入导致电荷相斥，不利于絮凝剂之间的桥连[13]，反而导致絮凝率降低。比较Ca2+、Mg2+对絮凝效果的影响，可以看出Ca2+更适合作絮凝菌BMF03的助凝剂，最适投加量为2.0%。

2.7 絮凝活性的分布(图7)

图7 絮凝活性分布

由图7可知，发酵液的絮凝率为90.2%，上清液的絮凝率为85.6%，离心沉淀的絮凝率仅为36%，空白培养基作为阴性对照，其絮凝率接近零。说明MBF03的絮凝活性成分主要分布在发酵上清液中。对于絮凝菌MBF03，其絮凝活性成分是胞外分泌物，这些分泌物大部分扩散到上清液中，使得上清液具有较高的絮凝活性[12]；菌体表面附着的少量胞外分泌物以及菌体本身的细胞外被(多糖类物质或者糖蛋白)[14]使得离心沉淀也有较低的絮凝活性。

3 结论

单因素实验结果表明，絮凝菌MBF03的最适碳源和氮源分别为葡萄糖和硝酸铵、最适pH值为6、最适接种量为4%；菌体生长与活性物质的分泌与累积存在24 h的时间延迟；Ca2+的助凝效果优于Mg2+；絮凝活性成分主要分布在发酵上清液中。

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