丹皮酚合成过程中抑菌活性的变化研究

于曙光，郑国生，潘大仁

(1.福建农林大学生命科学院，福建 福州 350002；2.青岛农业大学化学与药学院,山东 青岛 266109；3.青岛农业大学研究生处,山东 青岛 266109)

丹皮酚，又名芍药醇、牡丹酚，化学名为2-羟基-4-甲氧基苯乙酮，是牡丹干燥根或全草的主要有效活性成分，具有抑菌抗炎、解热镇痛、降压利尿、抗凝血、抗过敏、增强免疫功能等作用[1，2]，在医药、香料、化工领域应用广泛。

天然丹皮酚都是从中草药中提取，如从徐长卿和牡丹皮中通过水蒸气蒸馏、超临界萃取等方法提取[3～5]。由于原料昂贵，提取效率较低，使丹皮酚的应用受到了很大的限制。化学合成使丹皮酚大规模工业化生产成为可能，且节约了天然药材资源。化学合成法是将间苯二酚乙酰化制得2，4-二羟基苯乙酮,再经甲基化制得丹皮酚[6]。

作者在此采用化学合成法，考察丹皮酚在化学合成过程中3种化合物(原料间苯二酚、中间产物2，4-二羟基苯乙酮、主产物丹皮酚)抑菌活性的变化，从而初步了解丹皮酚的各个官能团在抑菌过程中的作用，拟为丹皮酚抑菌作用机理的研究奠定基础，为研发高抑菌活性的丹皮酚衍生物提供帮助[7]。

1 实验

1.1 丹皮酚的合成

丹皮酚的合成路线如下：

1.1.1 由间苯二酚合成2，4-二羟基苯乙酮

在250 mL三口烧瓶中加入15.4 mL冰乙酸,搅拌回流并控制油浴温度为110 ℃,加入20.5 g干燥的氯化锌,待氯化锌全溶后,加入间苯二酚11.2 g，然后升温至145 ℃回流2.0 h,将反应液倒入20 mL稀盐酸中室温冷却，放入冰箱0 ℃冷藏2 h,抽滤。用冰水洗涤反应物,得橙黄色固体,再用0.1 mol·L-1稀盐酸重结晶,自然冷却后再冷藏2 h,抽滤得到橙黄色针状晶体,干燥,称重，测熔点，并经GC-MS进行结构确认及纯度测定。

1.1.2 由2，4-二羟基苯乙酮合成丹皮酚

称取2，4-二羟基苯乙酮1.52 g加入到100 mL三口烧瓶中,依次加入碳酸钾1.38 g、三乙基苄基胺(TEBA)0.23 g、丙酮20 mL,搅拌15 min后加入碘甲烷0.75 mL，水浴恒温30 ℃,搅拌回流 3 h至反应完全。蒸馏除去丙酮后加入10 mL蒸馏水,再用盐酸调pH=2至固体析出。水蒸气蒸馏直至馏出液澄清透明。室温冷却后,放入冰箱0 ℃冷藏12 h,抽滤，干燥,称重，测熔点，并经GC-MS进行结构确认及纯度测定。

1.2 抑菌活性的测定

1.2.1 PDA培养基的配制

取200 g洗净去皮的土豆切块，加入1000 mL水，加热煮沸30 min左右，3层纱布过滤，取滤液加入20 g葡萄糖、15 g琼脂，加热煮沸3次后定容至1000 mL，趁热分装锥形瓶中，根据所需的浓度加入适量的间苯二酚、2，4-二羟基苯乙酮和丹皮酚，121 ℃灭菌20 min。

1.2.2 菌种的培养和菌饼的制备

选皿底平坦、直径为6 cm的洁净培养皿，经干燥灭菌后，在无菌操作条件下倾入PDA培养基，制成平板。待冷凝后接入供试菌种。置25 ℃恒温箱培养，待菌落均匀布满培养基时，用直径为9 mm的打孔器在上述菌落边缘切下带菌培养基，即为菌饼。

供试菌种为11种植物病原真菌：白菜黑斑病菌(HB)、苹果腐烂病菌(FL)、黄瓜枯萎病菌(HK)、小麦赤霉病菌(CM)、小麦纹枯病菌(WK)、大葱紫斑病菌(ZB)、黄瓜灰霉病菌(HM)、葡萄炭疽病菌(PTJ)、棉花枯萎病菌(MK)、苹果斑点落叶病菌(BDLY)、葡萄黑痘病菌(PHD)。

1.2.3 抑菌活性的测定

取已灭菌的含有间苯二酚、2，4-二羟基苯乙酮和丹皮酚的培养基，趁热摇匀，迅速倒入直径9 cm的培养皿中制成平板。每平板约需培养基15 mL左右，每种物质重复3次，同时每个菌种制作一个空白对照平板。

待上述各培养基冷凝后，在超净台上用接种针将菌种按每皿一针分别移入不同的培养基中，置于25 ℃左右的恒温培养箱中培养，每天测量菌落直径，直至空白对照组的培养皿长满菌落。每个菌落按十字交叉法测量，其平均值即为菌落直径。按下式计算抑菌率：

式中：纯生长量(mm)=菌落直径-菌饼直径。

1.2.4 最低抑菌浓度(MIC)的测定

将具有抑菌效果的物质的浓度进行逐级稀释后进行抑菌实验，以不长菌的最低的溶液浓度作为最低抑菌浓度。

2 结果与讨论

2.1 2，4-二羟基苯乙酮和丹皮酚的结构表征

(1)2，4-二羟基苯乙酮 熔程142.6～143.3 ℃(文献值142.0～144.0 ℃)。经GC-MS谱图分析，m/z为152、137、81、69、53、43,可以确认该化合物为2，4-二羟基苯乙酮，纯度为99%。

(2)丹皮酚 熔程48.6～49.3 ℃(文献值49.0～51.0 ℃)。经GC-MS谱图分析，m/z为166、151、108、95、69、43，可以确认该化合物为丹皮酚，纯度为100%。

2.2 不同浓度丹皮酚对11种病原真菌的抑制作用(表1)

表1 不同浓度丹皮酚对11种病原真菌的抑制作用

由表1可以看出，丹皮酚浓度为0.5 g·L-1时，对11种病原真菌均具有较强的抑菌活性，且有明显差异。因此，采用0.5 g·L-1丹皮酚考察各物质的抑菌率，从而对比抑菌活性的变化。

2.3 3种物质对11种病原真菌的抑菌率及最低抑菌浓度的比较

在相同浓度(0.5 g·L-1)下，间苯二酚、2，4-二羟基苯乙酮和丹皮酚对11种病原真菌的抑菌率和最低抑菌浓度对比见表2。

由表2可以看出，0.5 g·L-1的2，4-二羟基苯乙酮的抑菌率大于或等于同浓度丹皮酚的抑菌率，两者均远远大于同浓度间苯二酚的抑菌率。

3种物质对于11种病原真菌的最低抑菌浓度差别很大，但对于同种真菌而言，2，4-二羟基苯乙酮的最低抑菌浓度都是最小的，这也意味着对于上述11种病原真菌， 2，4-二羟基苯乙酮的抑菌效果是最好的。由此可推测，酚类分子中乙酰基的引入对抑菌活性起到了非常重要的作用，而酚羟基的甲基化的作用却并不显著。

表2 3种物质对11种病原真菌的抑菌率及最低抑菌浓度的比较

3 结论

研究了在丹皮酚合成过程中，原料间苯二酚、中间产物2，4-二羟基苯乙酮、主产物丹皮酚对11种植物病原真菌的抑菌活性的变化，并通过这种变化来推测影响丹皮酚抑菌活性的主要官能团。从3种物质的结构表征及对应的抑菌活性可以初步推测：在酚类分子中，单独的酚羟基的抑菌活性较低，乙酰基的引入大幅提高了抑菌活性，而酚羟基的甲基化对抑菌活性的影响不大。

参考文献：

[1] 章灵华，肖培根，黄艺，等.丹皮酚的药理与临床研究进展[J].中国中西医结合杂志，1996，16(3)：187-189.

[2] 巩丽萍，王少云.徐长卿及丹皮酚的研究进展[J].食品与药品，2005，7(6A)：14-17.

[3] 吴晓慧，吴国荣，张卫明，等.丹皮酚提取、磺化及对植物病原菌的抑菌试验[J].中药材，2003，26(11)：778-780.

[4] 杨炳火，高运军.不同提取法对徐长卿中丹皮酚含量的影响[J].时珍国医国药，1998，9(5)：4173-4176.

[5] 林英光，姚煜东.牡丹皮超临界萃取及其萃取物的应用研究[J].牙膏工业，2002，(4)：33-35.

[6] 许同桃，高健，许兴友，等.丹皮酚及其衍生物的研究进展[J].中国药业，2008,17(3):3-5.

[7] 张前军，杨小生，郝小江.我国天然抗菌药物研究进展[J].中草药，2008，39(2):304-308.