RsrA-CFP融合蛋白的克隆表达及圆二色性分析

陈 欢，叶邦策

(华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237)

天蓝色链霉菌是研究链霉菌的模式菌，2002年完成测序工作，预测基因大约为7825个，调控基因占到12.3%[1]。σR(sigR)是天蓝色链霉菌细胞内氧化还原自稳的广域调控子，受σR调控的基因超过30个。trxBA和trxC是受σR调控的下游基因，编码硫氧还原蛋白及二硫键还原途径相关的酶基因。trxBA和trxC基因受到σR调控激活后开始大量转录表达，翻译出硫氧还原蛋白和二硫键还原途径的相关酶，这些酶快速地发挥它们的酶活性，以最快速度消除由于氧化压力对细胞内蛋白带来的损伤，使天蓝色链霉菌安全度过恶劣的氧化状态，忍受极端的环境[2]。

RsrA蛋白是调控σR活性的anti-sigR因子，对天蓝色链霉菌的σR调控机理的研究非常重要。

为深入研究RsrA蛋白的功能，作者在此将RsrA蛋白用青色荧光蛋白CFP进行标记融合表达[3，4]，通过构建rsrA/cfp/pET-28a(+)融合表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达；利用镍柱亲和层析分离纯化RsrA-CFP蛋白，并用SDS-PAGE鉴定蛋白分子量和纯度；利用圆二色性初步测定RsrA-CFP融合蛋白二级结构，为RsrA蛋白的后续功能研究奠定基础。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

天蓝色链霉菌M145，上海交通大学邓子新教授馈赠；大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)、pET-28a(+)质粒，生物反应器工程国家重点实验室保藏；pECFP-N1质粒，华东理工大学杨弋教授馈赠。

1.1.2 培养基

LB培养基：称取2.5 g LB粉末，加入去离子水，搅拌至全部溶解，定容到100 mL。若配制固体培养基，则另加入1.5%琼脂。121 ℃灭菌30 min，冷却备用。

YEME培养基：分别称取3 g酵母提取物、5 g蛋白胨、3 g麦芽提取物、10 g葡萄糖，加入去离子水，搅拌至全部溶解，定容到1000 mL。115 ℃灭菌20 min，冷却后添加2 mL 2.5 mol·L-1的MgCl2·6H2O(121 ℃灭菌30 min)。

1.1.3 试剂

限制性内切酶EcoRI、HindⅢ、NcoI、DNA聚合酶rTaq、GC Buffer、Buffer、dNTP、T4连接酶、DNA ladder，Takara公司；LB粉末、琼脂糖凝胶DNA回收纯化(离心柱型)试剂盒、细菌基因组DNA抽提(离心柱型)试剂盒、PCR产物回收纯化(离心柱型)试剂盒，上海捷瑞；琼脂糖，上海博升；质粒小提(离心柱型)试剂盒，天根生化。测序由上海美季生物公司完成，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1rsrA和cfp基因的克隆

将天蓝色链霉菌M145接种至YEME培养基中，于30 ℃、200 r·min-1培养3～4 d，进行基因组抽提。根据CFP和RsrA蛋白融合特点进行引物设计：rsrA正向引物RsrAA:5′-CATGCCATGG-GCAGCTGCGGAGAGCCG-3′(NcoI)，rsrA反向引物RsrAB:5′-CCGGAATTCGGACTCCTGCGGGG-CCG-3′(EcoRI)，cfp正向引物CFPA:5′-CGGAATTCGGAGGAAGCATGGTGAGCAAGGGCGA-3′(EcoRI)，cfp反向引物CFPB:5′-CCCAAGCTTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′(HindⅢ)。除必要的酶切位点和保护碱基外，rsrA正向引物增加2 bp用于消除移码突变，cfp正向引物增加9 bp的linker用于消除结构域之间的相互影响。

rsrA基因扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸 7 min。rsrA基因扩增体系：ddH2O 15 μL，GC Buffer(×2) 25 μL，dNTP 4 μL，RsrAA(20 μmol·L-1) 2 μL，RsrAB(20 μmol·L-1) 2 μL，M145基因组2 μL，rTaq 0.3 μL，总体系50 μL。

cfp基因扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸 7 min。cfp基因扩增体系：ddH2O 35 μL，Buffer(×10) 5 μL，dNTP 4 μL，CFPA(20 μmol·L-1) 2 μL，CFPB(20 μmol·L-1)2 μL，质粒pECFP-N1 2 μL，rTaq 0.3 μL，总体系50 μL。

1.2.2rsrA/pET-28a(+)表达质粒的构建

将rsrA片段与质粒pET-28a(+)分别进行NcoI和EcoRI双酶切，酶切条件为37 ℃水浴3 h。双酶切体系：Buffer K(×10) 5 μL，ddH2O 31 μL，BSA 5 μL，rsrA或pET-28a(+) 5 μL，EcoRI 2 μL，NcoI 2 μL，总体系50 μL。

将双酶切后的rsrA与pET-28a(+) 在连接体系中按10∶1连接，连接条件为16 ℃水浴过夜。连接体系：Buffer(×10) 1 μL，ddH2O 7.0 μL，rsrA0.4 μL，pET-28a(+) 1.2 μL，T4连接酶0.4 μL，总体系10 μL。

将10 μL连接液全部转化大肠杆菌DH5α，菌液PCR鉴定后将阳性克隆送测序。

1.2.3rsrA/cfp/pET-28a(+)融合表达质粒的构建

抽提上述重组质粒rsrA/pET-28a(+)，将cfp片段与质粒rsrA/pET-28a(+)进行EcoRI和HindⅢ双酶切，酶切条件为37 ℃水浴3 h。双酶切体系：Buffer M(×10) 5 μL，ddH2O 36 μL，cfp或rsrA/pET-28a(+) 5 μL，EcoRI 2 μL，HindⅢ 2 μL，总体系50 μL。

将双酶切后的cfp与rsrA/pET-28a(+)在连接体系中按10∶1连接，连接条件为16 ℃水浴过夜。连接体系：Buffer(×10) 1 μL，ddH2O 6.9 μL，cfp0.4 μL，rsrA/pET-28a(+) 1.3 μL，T4连接酶0.4 μL，总体系10 μL。

将10 μL连接液全部转化大肠杆菌DH5α[5]，双酶切筛选鉴定后将阳性克隆送测序，随后将序列完全正确的阳性质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)。

1.2.4 RsrA-CFP蛋白的诱导表达及其条件优化

1.2.4.1 RsrA-CFP蛋白诱导表达及荧光测定

对上述构建的rsrA/cfp/pET-28a(+)/BL21(DE3)菌种进行37 ℃培养过夜活化，按1%接种量接种至20 mL含有卡那霉素抗性(50 μg·mL-1)的LB培养基中继续培养，于30 ℃诱导表达10 h。然后于45 000 r·min-1离心20 min，弃上清收集菌体，加入10 mL PBS缓冲溶液悬浮菌体，进行荧光测定。酶标参数设定为荧光测定，激发光440 nm，扫谱记录460～600 nm。以波长为横坐标、相对荧光值为纵坐标，用GraphPad Prism软件绘制荧光曲线。

1.2.4.2 最佳 IPTG浓度的确定

在上述实验中，RsrA-CFP蛋白表达量较低，因此需要对其进行表达优化。将菌种按1%接种量接种至20 mL含有卡那霉素抗性(50 μg·mL-1)的LB培养基中，于37 ℃培养3 h左右，分别加入0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的100 mmol·L-1IPTG于30 ℃摇床诱导表达10 h。然后于45 000 r·min-1离心20 min，弃上清收集菌体，加入10 mL PBS缓冲溶液悬浮菌体，测定相对荧光值，确定最佳IPTG浓度。

1.2.4.3 最佳OD600的确定

将菌种按1%接种量接种至20 mL含有卡那霉素抗性(50 μg·mL-1)的LB培养基中，于37 ℃培养至OD600值分别为0.5、0.6、0.8、1.0时，加入1.0% IPTG，于30 ℃摇床诱导表达10 h。然后于45 000 r·min-1离心20 min，弃上清收集菌体，加入10 mL PBS缓冲溶液悬浮菌体，测定相对荧光值，确定最佳OD600。

1.2.5 SDS-PAGE鉴定

采用上述最佳条件进行蛋白的诱导表达，菌体经超声破碎后，收集粗蛋白液。利用融合蛋白尾部的His标签进行镍柱纯化，操作步骤参照说明书。随后进行SDS-PAGE蛋白电泳鉴定其分子量和纯度。

1.2.6 圆二色性测定RsrA-CFP融合蛋白结构

用PBS(pH值8.0)缓冲溶液将镍柱纯化的RsrA-CFP透析过夜，将透析后的样品稀释至0.5 μmol·L-1。圆二色性仪器预备，以5 L·min-1的流速通入氮气，测量波长设定为190～260 nm，带宽0.25 nm，测量速度2.5 nm·s-1，测量池10 mm(0<吸光值<2)。在相同参数条件下，先测定空气背景基线，再测定PBS缓冲溶液和RsrA-CFP-PBS样品的CD值，结果用CDNN软件进行分析。

2 结果与讨论

2.1 rsrA和cfp基因的克隆(图1)

M1.2000 bp Marker M2.5000 bp Marker 1.rsrA基因扩增产物2,3.pET-28a(+)质粒抽提物 4.cfp基因扩增产物

由图1可看出，rsrA目的条带大小为333 bp(图1a)；cfp目的条带大小为744 bp(图1b)。两者均与电泳图上的实际位置相一致，而且PCR反应的特异性很好，无杂带，纯化后可用于后续实验。

2.2 rsrA/pET-28a(+)表达质粒的构建与鉴定(图2)

M.2000 bp Marker 1～10.PCR产物

理论上rsrA/pET-28a(+)PCR后的条带大小为333 bp。由图2可看出，大部分克隆菌都扩增出大小正确的条带，选择2#去测序，结果序列正确，保存此菌液，用于后续实验。

2.3 rsrA/cfp/pET-28a(+)融合表达质粒的构建与鉴定(图3)

M.5000 bp Marker 1,2.pET-28a(+)质粒抽提物3，4，5.挑取的单克隆菌液质粒双酶切产物

理论上双酶切后的2条条带大小分别为1100 bp和5000 bp左右。由图3可看出，条带大小均正确，可认为是阳性克隆，选择3#去测序，结果序列正确，可用于后续实验。

2.4 RsrA-CFP蛋白诱导表达及条件优化

2.4.1 RsrA-CFP蛋白诱导表达及荧光测定

荧光值的高低可以认为是融合蛋白表达量的高低，因此，可省去用SDS-PAGE蛋白电泳分析蛋白诱导表达量的步骤。酶标仪测定时，先扫全谱，确定其最大发射峰，再确定其最大激发峰。RsrA-CFP蛋白的荧光测定曲线见图4。

图4 RsrA-CFP蛋白的荧光测定曲线

由图4可看出，最大发射峰为478 nm，与文献值相吻合。最大激发峰为440～458 nm，与文献的CFP荧光特性相吻合，可以确定其表达了目标蛋白RsrA-CFP。

2.4.2 最佳IPTG浓度的确定

IPTG浓度对RsrA-CFP蛋白表达的影响见图5。

图5 IPTG浓度对RsrA-CFP蛋白表达的影响

由图5可看出，随着IPTG浓度的增大，478 nm处的相对荧光值先升高后降低，在1.0%时达到最高。因此，确定最佳IPTG浓度为1.0%。

2.4.3 最佳OD600的确定

OD600对RsrA-CFP蛋白表达的影响见图6。

图6 OD600对RsrA-CFP蛋白表达的影响

由图6可看出，478 nm处的相对荧光值随着OD600的升高而降低。考虑到OD600过低不利于蛋白表达，确定最佳OD600为0.5左右。

2.5 SDS-PAGE鉴定(图7)

M.蛋白Marker 1.RsrA-CFP

理论上RsrA-CFP蛋白分子量为40 kD左右。由图7可看出，条带大小基本正确，纯度较高，可用于后续实验。

2.6 圆二色性测定RsrA-CFP融合蛋白结构(图8)

图8 圆二色性测定RsrA-CFP蛋白二级结构

由图8可看出，RsrA-CFP蛋白二级结构特征CD峰明显。CDNN软件分析后显示，在蛋白二级结构中，螺旋结构占32.2%、平行结构占8.0%、反向平行结构占9.3%、β折叠占16.7%、无规则卷曲占34.4%。这说明构建表达的融合蛋白RsrA-CFP得到了很好的折叠，预示着非常好的活性。

2.7 讨论

(1)首次将RsrA与CFP进行融合表达，这是利用青色荧光蛋白CFP作为荧光标记具有的优点，有益于简化后续确定诱导条件时的检测程序，较传统SDS-PAGE蛋白电泳大幅缩短了检测时间，并降低了成本。

(2)大肠杆菌能够将天蓝色链霉菌内rsrA基因与cfp进行融合可溶表达，证明了这两种原核生物之间的基因相容性。

(3)利用圆二色性初步测定RsrA-CFP蛋白的CD值，CDNN软件分析得到二级结构组成，螺旋结构占了1/3左右，说明构建表达的融合蛋白RsrA-CFP得到了很好的折叠，蛋白很成熟，为后续RsrA蛋白的进一步功能研究奠定了基础。

3 结论

以天蓝色链霉菌M145基因组作模板，扩增σR(sigR)的anti-sigR因子基因rsrA，得到了333 bp基因；以质粒pECFP-N1作模板，扩增青色荧光蛋白基因cfp，得到了744 bp基因。将两个基因融合串联，构建rsrA/cfp/pET-28a(+)融合表达质粒。利用荧光检测技术，确定大肠杆菌BL21(DE3)在OD600为0.5时，用1 mmol·L-1IPTG进行诱导能大量表达融合蛋白RsrA-CFP。用镍柱亲和层析分离纯化RsrA-CFP蛋白，并用SDS-PAGE鉴定其分子量为40 kD左右。利用圆二色性初步测定RsrA-CFP蛋白的CD值，经CDNN软件分析得到：螺旋结构占32.2%、平行结构占8.0%、反向平行结构占9.3%、β折叠占16.7%、无规则卷曲占34.4%，为RsrA蛋白的功能研究奠定了基础。

参考文献：

[1] Bentley S D,Chater K F，Cerdeno-Tarraga A M，et al.Complete genome sequence of the model actinomyceteStreptomycescoelicolorA3(2)[J].Nature,2002,417(6885):141-147.

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[3] Baird G S，Zacharias D A，Tsien R Y.Biochemistry，mutagenesis，and oligomerization of DsRed，a red fluorescent protein from coral[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97(22):11984-11989.

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[5] Sambrcok J，Russell D W.Molecular Cloning——A Laboratory Manual(third edition)[M].New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001:4-100.