复方松及片提取物对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响

危金松 李金优 梅汝焕 曾豆豆 李子刚 陈季强 汤慧芳

1.湖北省京山县中医院，湖北 京山 431800；2.浙江大学医学院 浙江省呼吸药物研究实验室，浙江 杭州 310058；3.浙江大学医学院附属妇产科医院，浙江 杭州 310000

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种原因不明、与年龄相关的破坏性肺部疾病，以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱导致肺间质纤维化为特征，通常这种实质病变具有不可逆性及严重的致死率[1]。目前尚无有效的治疗手段来阻止或逆转纤维化的过程，因此寻找可以在上皮损伤过度修复过程中发挥作用的药物，成为探索终止和逆转肺纤维化过程的关键。

复方松芨片（Compound Formula Rosin and Bletilla Table，CFRB）的主要成分是白及（Bletillae Rhizoma）、沙参（Fourleaf Ladybell Root，Radix Adenophorae）、百部（Stemona Root，Radix Stemonae）等，这些成分均归肺经，具清肺、化痰、止咳、扶正抗痨、止血生肌等功能，临床上主要用于各型结核病出血、慢性咳喘及慢性胃肠疾病等，临床效果显著。有文献报道白及对矽肺肺部症状有改善作用[2]，而沙参对博莱霉素诱导的肺纤维化有改善作用[3-5]，但作用尚不清楚。本研究采用博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型，研究CFRB对肺纤维化病理改变的影响，进一步检测代表性的炎症因子如TGF-β1的分泌，肺组织中羟脯氨酸的含量等，并从mRNA表达水平进行了相关机制研究，为临床治疗肺纤维化提供新途径，为老药新用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药品、试剂和仪器

ICR小鼠，雄性，8周，体重在20～22 g，由浙江大学动物实验中心提供，动物合格证号：2007000526749。动物饲养及操作过程均遵守浙江大学《实验动物管理条例》要求。

博莱霉素（Sigma 公司，批号：9041-93-4），复方松及片（京山中医院，批号：20100501），地塞米松磷酸钠注射液（浙江省仙琚制药股份公司）。

Real time PCR 相关试剂[包括 dNTP Mixture，Oligo（dt）18 primer，RNase Inhibitor，M-MLV Reverse Transcriptase，宝生物工程（大连）有限公司]，羟脯氨酸测定试剂盒（凯基，KGT030-2），小鼠TGF-β1 ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），小鼠β-actin、PDE8A引物（由上海生工生物工程有限公司合成）。

PCR仪（Eppendoff公司），水平电泳仪（英国CLP公司）。

1.2 模型建立与实验分组

根据本实验室建立的小鼠肺纤维化造模方法，对小鼠进行4%水合氯醛麻醉（280 mg/kg），然后有创气道给药法滴入生理盐水配制的博莱霉素（2.5 g/L），剂量为2.5 mg/kg，地塞米松组腹腔注射地塞米松2.0 mg/kg，正常组滴入同等体积的生理盐水。

CFRB提取液配制方法：将片剂粉碎研磨后称重，5倍重量的蒸馏水浸泡过夜，5000 g离心取上清，然后70℃水浴浓缩至1 g/mL浓度，依次稀释成0.20、0.04 g/mL。灌胃给药剂量分别为低剂量0.4 g/kg、中剂量2.0 g/kg、高剂量10.0 g/kg，博莱霉素气道滴入后即开始给药，博莱霉素给药后14 d处理，半侧肺进行支气管肺泡灌洗及留取另半侧肺组织进行病理学、蛋白及分子生物学检测等。

1.3 肺组织病理学观察

小鼠股动脉放血处死后，留取肺组织用10%福尔马林溶液固定，制备石蜡切片，作病理检查，进行Masson染色，观察肺组织纤维化改变，Masson染色组织切片上蓝染色的为胶原蛋白。

1.4 肺组织中羟脯氨酸含量测定

取右肺称重，加入1 mL水解液匀浆后100℃水浴（电磁炉保温档）水解20 min，调pH值至6.0～6.8，然后加入蒸馏水10 mL，混匀，3500 r/min 离心 10 min，取 1 mL 上清，60℃水浴15 min，冷却后，550 nm波长读取数值。计算公式：

羟脯氨酸含量（μg/mL）=（测定管吸光度-对照管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）×标准管含量（μg/mL）×[水解总体积（mL）/取样量（mL）]

1.5 BALF 中转化生长因子-β1（TGF-β1）的 ELISA测定

取1 mL生理盐水灌洗肺组织得到肺泡灌洗液。以2000 r/min离心10 min，留取上清液。按照说明书进行TGF-β1的ELISA含量测定。

1.6 Real time-PCR测定肺组织中磷酸二酯酶8A的mRNA的表达

取液氮固定的左肺组织加入1 mL Trizol于冰浴中匀浆，提取RNA，逆转录合成cDNA，于-20℃保存。以cDNA为模板，用目的基因PDE8引物进行定量PCR扩增，内参为βactin。引物序列如下： 小鼠 β-actin上游 （5'-3'）：GAT TAC TGC TCT GGC TCC TAG C；小鼠 β-actin 下游（5'-3'）：GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG C。扩增条件为：95℃ 10 s，60℃30 s，72℃ 45 s，25 个循环。 小鼠 PDE8A 上游 （5'-3'）：CCA TCA CCA AGG TAA TCA； 小鼠 PDE8A 下游 （5'-3'）：TCC GTG GTG GGA CAT CAT。 扩增条件为：95℃ 10 s，48.9℃ 30 s，72℃ 45 s，40 个循环。

1.7 统计学方法

采用SPSS 10.0统计软件进行数据分析，计量资料数据以均数±标准差（）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CFRB提取物对博莱霉素诱导肺组织纤维化的病理变化的影响

博莱霉素气道滴入后14 d，成功诱导了肺组织纤维化病变。Masson染色呈蓝色的即沉积的胶原纤维。模型组气道附近胶原沉积明显，肺泡组织结构被严重破坏，间隔消失形成空洞。正常组的肺组织肺泡结构清晰且完整，无炎症细胞浸润。而地塞米松组对抗博莱霉素诱导的肺纤维化病变作用不明显。CFRB提取物对此纤维化病变的抑制作用呈现出剂量依赖性，低剂量组效果不明显，高剂量对此纤维化有明显抑制作用。见图1。

图1 CFRB提取物对博莱霉素致肺纤维化的影响（×10）

2.2 CFRB提取物对博莱霉素诱导纤维化肺组织羟脯氨酸含量的影响

肺组织中羟脯氨酸含量在博莱霉素气道滴入后14 d即快速上升，与正常组比较差异有高度统计学意义（P<0.01）。地塞米松组羟脯氨酸含量有抑制趋势，但与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。低、中剂量CFRB提取物对羟脯氨酸的影响也不明显，但高剂量组下降较明显，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

图2 CFRB提取物对肺组织匀浆中羟脯氨酸含量的影响

2.3 CFRB提取物对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠BALF中TGF-β1含量的影响

在博莱霉素刺激后14 d，TGF-β1上升迅速，达325 pg/mL，明显高于正常对照组（P<0.001）。而CFRB提取物各剂量对TGF-β1的分泌较均模型组有明显抑制作用，尤以高剂量组为显著 （P<0.001）。而地塞米松组较模型组也能明显抑制TGF-β1 的分泌（P<0.001）。

图3 CFRB提取物对BALF中TGF-β1水平的影响

2.4 CFRB提取物对博莱霉素诱导纤维化肺组织中PDE8A mRNA表达的影响

根据定量PCR结果，博莱霉素刺激后肺组织中PDE8A的mRNA表达量明显增加，这与肺纤维化的趋势相符。与正常组比较，14 d的PDE8A mRNA表达差异有高度统计学意义（P<0.01），相对表达量比值为0.49；CFRB提取物各剂量组PDE8A mRNA的相对表达量与模型组比较均有明显下降（P<0.05或P<0.01）。地塞米松组PDE8A的表达也有下降，但差异无统计学意义（P>0.05）。

图4 博莱霉素诱导PDE8A mRNA的变化

3 讨论

复方松及片里的成分较多，主要成分白及，具有止血生肌、化痰敛肺的作用。临床多用于大咯血、肺结核少量咯血等的治疗，效果较显著[6-7]。白及水提物中的主成分为白及多糖[8-9]，有研究表明其具有抗菌[10]、抗氧化[11]、抑制大鼠皮肤成纤维细胞VEGF的mRNA表达[12]等作用。中药治疗矽肺的记载中提及白及对矽肺症状有治疗作用，但对X光胸片无改善[2]。沙参具有祛痰作用，有研究报道其对博莱霉素诱导的实验性肺纤维化有明显改善作用[3]，能降低肺组织纤维连接素、层粘蛋白的含量[4]。对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠也有明显改善作用，能降低肺组织羟脯氨酸含量[5]。百部生物碱具有止咳、化痰、平喘、抗菌等作用[13]。Liao等[14]研究发现百部水提取物对Carbacol、组织胺、Kcl所致的离体豚鼠支气管平滑肌痉挛有松弛作用。

磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDEs）是细胞内第二信使cAMP和cGMP的水解酶，负责维持细胞内第二信使浓度平衡，在信号传递过程中扮演着重要作用。PDEs作为一个有11个家族成员的蛋白酶超家族，拥有非常多的变异体。最近的研究表明PDE8家族是保持cAMP稳态的调节者之一，在淋巴细胞中高表达，提示其在调节免疫和炎症中起作用，但目前对其抗炎作用的研究尚无。目前已知哺乳动物PDE8家族包括2个基因PDE8A、PDE8B。两种异构体都对cAMP有特异性且对底物有着很高的亲和力。PDE8A mRNA的表达十分广泛并在许多组织被检测到，PDE8已被证实与淋巴细胞趋化相关，通过干预淋巴细胞内cAMP信号通路可以阻止淋巴细胞透过毛细血管向炎症病灶区聚集。抑制剂实验证明抑制PDE8可以弥补单独抑制PDE4的不足，阻止炎症病灶区对淋巴细胞的募集作用[15]。

博莱霉素诱导的纤维化与IPF的病理生理相似，是目前应用最广泛的肺纤维化模型，用药后14～28 d形成肺纤维化[16]。最近有研究报道PDE亚型抑制剂如PDE4抑制剂-罗氟司特和西洛司特、PDE5抑制剂-西地那非等均对博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型有作用[17-19]。而PDE8目前功能尚不清楚。笔者研究发现，博莱霉素刺激14 d肺泡炎症细胞浸润，大量巨噬细胞，淋巴细胞聚集并释放到肺泡腔，胶原沉积于肺泡间质，表明本实验肺纤维化模型制备成功。在这个过程中大量的信号因子被释放出来，诱导肺泡上皮细胞的迁移与增殖如TGF-β1。TGF-β1是主要导致纤维化的细胞因子，可直接作用于成纤维细胞，主要由巨噬细胞分泌[20]。笔者在研究中发现PDE8A在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型上表达上调，同时发现了CFRB的粗提物对其有效，检测代表性的炎症因子如TGF-β1等的分泌及羟脯氨酸含量等指标，结果均提示CFRB能有效对抗博莱霉素诱导的肺纤维化改变。笔者将上述结果中的TGF-β1含量与PDE8A mRNA表达进行了相关分析，结果显示TGF-β1含量的变化趋势与PDE8A mRNA表达量间的相关系数为0.541（P<0.05）。提示PDE8A与肺纤维化间存在相关性，提示PDE8A可能是CFRB的作用靶点，也提示PDE8A可能是肺纤维化的治疗靶点。

综上所述，CFRB提取物能有效对抗肺纤维化病变，其机制涉及PDE8A亚型在博莱霉素诱导的小鼠纤维化肺组织中高表达，提示CFRB可能成为肺纤维化治疗药物，同时PDE8A可能是一个较好的抗肺纤维化药物的研究靶点。

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