MS-275体外诱导膀胱癌细胞凋亡的机制探讨

曲 巍 刘 锋 姬西宁 王立明 朱有华

1.解放军第一六一医院泌尿外科，湖北武汉 430010；2.第二军医大学附属长征医院器官移植研究所，上海 200003

膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一，每年有350000例以上的新发病例，并且有145 000 人死于此病[1]。其生物学行为呈多样性，而容易复发是其重要生物学特性。目前对其发生、复发、浸润及转移的机制尚未完全明了，大部分膀胱癌在确诊时是表浅性的，经过局部手术治疗后复发率为50%～70%，进展率为15%～30%。现有的传统抗肿瘤药物治疗尚有一定的局限性，从新的角度寻求有效的抗肿瘤药物有望取得突破性进展。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deactylase inhibitors，HDAC抑制剂）是一类通过抑制组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）而改变染色质结构，在转录水平进行基因表达调控的化合物，依其化学结构可分为六类，而MS-275 是苯酰胺类HDAC抑制剂中最具活性的一种化合物，其显示出对一些血液系统肿瘤[2]和实体肿瘤[3]有较强的抗肿瘤活性。本实验将探讨MS-275 对膀胱癌细胞的诱导凋亡作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人膀胱癌T24 细胞来源于中国科学院上海生物细胞研究所，实验时取对数生长期的细胞，在含10%小牛血清的细胞培养基（DMEM）培养液中培养，在 37℃、5%CO2、饱和湿度条件下生长，0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2 MTT实验

T24 细胞以 5 ×104/mL、100 μL/孔， 接种于 96 孔培养板，培养 24 h 后，分别加入浓度为 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L的MS-275 作为5个实验组，阴性对照组不加MS-275，空白对照组为单纯DMEM培养液，每组各设5个复孔。继续培养48 h，每孔加入5 g/L的MTT溶液10 μL，再培养 4 h，吸出孔内培养液，每孔加100 μL二甲基亚砜（DMSO），酶标仪测定吸光度，选择492 nm波长，用空白对照组调零，计算细胞生长抑制率（%）＝（1-实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。以细胞生长抑制率与药物浓度的对数作图，在图上求出MS-275 对T24 细胞的半抑制浓度（IC50）值。选取接近于IC50 值的浓度用于下一步实验。

1.3 荧光显微镜观察凋亡的形态学变化

将T24 细胞以1 ×105/孔接种于6 孔培养板，观察细胞贴壁且生长良好后，加入浓度为4.0 μmol/L的MS-275 作为实验组，非药物处理组作为对照组，继续分别培养12、24、48 h，细胞经胰蛋白酶消化收集后，以磷酸盐缓冲液（PBS）调整细胞密度为 1 ×106/mL，制成单细胞悬液，取 95 μL细胞悬液，加人100 μg/ml的吖啶橙染液 5 μL 混匀，取 10 μL 混合液于载玻片上，加盖玻片后于荧光显微镜（Olympus BX60）下（515 nm激发光）观察细胞形态学变化并摄片。

1.4 原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡

4 μmol/L 的 MS-275 分别处理细胞 12、24、48 h，设阴性对照，每个时间点设3个复孔，培养结束后收集细胞悬液，做细胞涂片，行TUNEL法处理及染色，并以二氨基联苯胺显色。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，分析细胞凋亡率。

1.5 流式细胞仪（FCM）检测细胞内Bcl-2 和Bax的变化

4 μmol/L 的 MS-275 分别处理细胞 12、24、48 h，收集后4%多聚甲醛固定，PBS液漂洗2次，加入1.5 mL破膜剂透化15 min后，离心去上清，重悬于150 μL破膜剂中，分别加入Bcl-2 和Bax的单克隆抗体，留取空白对照（不加单抗），避光反应30 min，PBS漂洗2次，每管加入FITC荧光标记的二抗，避光反应30 min，PBS漂洗2次，上FCM检测。

1.6 统计学方法

采用SPSS 15.0 统计软件进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT实验结果

经 MTT 法测定，浓度分别为 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L的MS-275 处理T24 细胞48 h后，细胞的生长抑制率分别为（4.59 ±2.37）%、（9.86 ±6.74）%、（22.82 ±7.55）%、（41.17 ±6.14）%、（65.02 ±6.21）%，通过作图求得 IC50 为（5.21 ±0.61）μmol/L。 选用接近IC50的4.0 μmol/L浓度作为实验浓度。

2.2 荧光显微镜观察结果

对照组基本为正常细胞，表现为细胞核形态规则，胞核DNA呈现黄绿色均匀弥散荧光。MS-275 处理12 h和24 h凋亡细胞逐渐增多，48 h后出现大量凋亡细胞，细胞呈现核固缩，呈现致密浓染的黄绿色荧光，部分细胞表现为核碎裂，还可见典型的出泡现象。见图1。

2.3 MS-275 诱导T24 细胞凋亡率（AI）的升高

MS-275 诱导T24 细胞凋亡呈明显的时间依赖性，T24细胞的凋亡率随MS-275 作用时间的延长而升高。MS-275作用 12、24、48 h 的 AI分别为（9.52 ±2.61）%、（17.76 ±3.75）%和（37.5 ±5.26）%，AI在 MS-275 作用 12 h 以上各组，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 MS-275 对Bcl-2 和Bax表达的影响

MS-275 作用 6、12 h，T24 细胞内 Bcl-2 蛋白的表达率即出现明显降低，而同时Bax蛋白的表达率出现明显升高（P＜0.05 或 P＜0.01）；24 h Bax的蛋白表达率逐渐降低 （P＜0.01）；此后随着作用时间的延长，Bcl-2 的蛋白表达率逐渐升高，而Bax的蛋白表达率逐渐降低，但差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。 见表1。

表1 MS-275对T24细胞Bcl-2，Bax蛋白表达率的影响（±s，%）

表1 MS-275对T24细胞Bcl-2，Bax蛋白表达率的影响（±s，%）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 Bcl-2 Bax对照组6 h 12 h 24 h 48 h 15.31 ±2.15 9.94 ±2.56*9.81 ±2.07*12.30 ±3.23 14.97 ±3.71 47.53 ±5.95 83.3 ±8.94**90.32 ±5.29**72.56 ±6.93**49.23 ±7.12

3 讨论

诱导肿瘤细胞凋亡是HDAC抑制剂抗肿瘤作用的重要机制之一。本实验用荧光染色法及TUNEL法观察到，微摩尔数量级的MS-275 即可诱导T24 细胞出现特征性的凋亡形态学改变，并且随作用时间的延长，凋亡细胞的相对数量呈增多趋势。随后的实验对其诱导膀胱癌细胞凋亡的机制进行了初步探讨。

抗肿瘤治疗可诱发肿瘤细胞对细胞内的损伤信号起反应，而细胞是否凋亡很大程度上决定于Bcl-2 家族蛋白之间的相互作用[4]。Bcl-2 是Bcl-2 基因家族中调节细胞凋亡的一个重要分子，能广泛抑制各种凋亡诱导因素引发的凋亡，其很可能影响凋亡最终通路上的中心环节。另一个Bcl-2 家族蛋白Bax是重要的异二聚体伴分子，可与Bcl-2 构成异二聚体，而Bax自身组成同二聚体。Bcl-2 必须结合Bax才能发挥作用。Bcl-2 与Bax蛋白量的比率决定异二聚体（Bcl-2/Bax）与同二聚体（Bax/Bax）的比值，这对决定细胞的凋亡易感性起关键作用[5]。本实验的检测结果表明，MS-275 作用T24 细胞后Bcl-2 的表达减弱，Bax的表达增强，说明MS-275 可下调Bcl-2 表达，上调Bax表达，这与HDAC抑制剂诱导其他恶性肿瘤细胞凋亡时对凋亡相关因子表达的影响相一致[6-7]。本实验还观察到MS-275 引起Bax表达的改变较Bcl-2 的改变更明显，而由于Bcl-2 和Bax表达的改变是同步的，这样就引起Bax/Bcl-2 发生更显著的变化。更重要的一点在于，凋亡率发生显著变化之前，Bcl-2 和Bax的表达即已发生显著的改变，这更表明Bcl-2 和Bax表达的改变是MS-275 诱导凋亡的启动环节上的作用因素。

本实验结果表明，HDAC抑制剂MS-275 通过诱导膀胱癌T24 细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用，Bcl-2 和Bax蛋白表达分别下调和上调是其诱导膀胱癌细胞凋亡的机制之一。HDAC抑制剂为膀胱癌的治疗提供了新的思路。

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