芦笋总黄酮及5种黄酮苷成分的体外抗氧化活性研究

姜云云， 叶光明*， 范国荣， 陈云红， 沐 韦， 潘小明

(1.中国人民解放军第101医院，江苏无锡214044;2.第二军医大学药物分析教研室，上海200433)

芦笋Asparagus officinalis L.是百合科天门冬属多年生宿根性草本植物，学名石刁柏，民间又称为文山竹、龙须菜、细百叶部、索罗罗等。研究表明，芦笋中含有非常丰富的黄酮类成分，是一种理想的绿色保健食品，具有降血脂、抗肿瘤、增强免疫力、抗疲劳和保护肝脏等药理活性［1-3］，这些功效与其含有的黄酮类成分关系密切［4-7］。到目前为止，鲜见有关芦笋中黄酮类化合物抗氧化活性的研究报道。为详细阐述芦笋中黄酮类化合物的抗氧化活性，本实验以维生素C为阳性对照，采用比色法测定芦笋总黄酮和5种黄酮苷对·OH、O2－和DPPH·的清除作用以及对大鼠红细胞氧化溶血的抑制作用，为进一步阐明芦笋作用机制提供实验依据。

1 材料

1.1 药材 芦笋鲜品购于当地超市，产地福建，经第二军医大学药学院生药教研室张巧艳教授鉴定。

1.2 仪器与试剂 美国Cary50型紫外分光光度计;二苯代苦味肼基自由基 (DPPH·)购自日本东京化成工业株式会社;还原性辅酶Ⅰ (NADH)、酚嗪二甲基硫酸盐(PMS)、四氮唑蓝 (NBT)、碱性桃红T均购自Sigma公司;其余试剂均为分析纯，购自中国医药集团上海化学试剂公司。

槲皮素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、芦丁、异鼠李素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、烟花苷和水仙苷对照品均为本实验室自制［采用ESI-MS结合1H-NMR(DMSO)和13C-NMR(DMSO)的方法鉴定结构，纯度＞98%］。

1.3 实验动物 SD大鼠，雌雄各半，体质量200～220 g，由第二军医大学实验动物中心提供。

2 方法与结果

2.1 芦笋总黄酮的制备 新鲜芦笋于60℃烘干备用，称取干燥芦笋400 g，加4000 mL 60%乙醇回流提取2 h，过滤，滤渣继续用3000 mL 60%乙醇回流提取2 h，过滤，合并滤液，于60℃减压浓缩至400 mL。

上述浓缩液经D101型大孔吸附树脂柱 (60 cm×4 cm)吸附1 h，再依次用水1500 mL、20%乙醇2000 mL和40%乙醇2000 mL洗脱。收集40%乙醇部分并于50℃减压浓缩至干，所得粉末再经Sephadex LH-20型葡聚糖凝胶柱富集纯化，即得芦笋总黄酮。经高效液相色谱法测定，其中槲皮素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、芦丁、异鼠李素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、烟花苷、水仙苷的质量分数分别为12.62%、23.28%、5.09%、4.89%、3.22%。

2.2 总黄酮及黄酮苷单体对·OH生成的影响［8］·OH可特异性地使碱性桃红T褪色，根据褪色的幅度可以测定·OH的生成量。实验步骤如下:于5 mL量瓶中依次加入碱性桃红 T(70 μg/mL)1 mL，3%H2O21 mL，2 mmol/L EDTANa2-Fe(Ⅱ)2 mL，混匀后加入不同体积的样品溶液，最后加0.15 mmol/L的pH 7.4的磷酸缓冲液至刻度。混匀后于37℃水浴放置30 min，对照组以水代替样品溶液，空白组以水代替样品及EDTANa2-Fe(Ⅱ)，以维生素C为阳性对照于520 nm比色测定，按照公式抑制率(%)= ［(A样品－A空白)/(A对照－A空白)］ ×100%计算抑制率，根据抑制率和样品浓度的拟合方程求得IC50值，结果见表1。阳性对照维生素C的IC50值为5.33 μg/mL。

表1 总黄酮及黄酮苷单体对·OH的抑制率(n=3)

2.3总黄酮及黄酮苷单体对O－2生成的影响［8］取适量NADH、PMS和NBT于同一量瓶中，加16 mmol/L，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液溶解，使NADH、PMS和NBT的浓度分别为73 μmol/L，15 μmol/L和50 μmol/L，O－2即由该NADH-PMS-NBT系统产生。取该混合溶液2.0 mL，分别加入系列浓度样品溶液1.0 mL，混匀后于560 nm比色测定。空白管不加PMS，对照管以水代替样品，按照公式抑制率(%)= ［(A空白－A样品)/A对照］ ×100%计算抑制率，根据抑制率和样品浓度的拟合方程求得IC50值，结果见表2。阳性对照维生素C的IC50值为3.80 μg/mL。

表2 总黄酮及黄酮苷单体对O－2的抑制率(n=3)

2.4 总黄酮及黄酮苷单体对DPPH自由基的清除作用 配制浓度为2×10－4mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存，备用。将样品配成系列浓度的乙醇溶液，吸取各浓度溶液1.0 mL于具塞离心管中，分别加入2×10－4mol/L的DPPH乙醇溶液4.0 mL，摇匀后室温放置30 min，以乙醇为对照，在517 nm处测定吸光度Ai。另取上述系列浓度的样品液各1.0 mL，分别加入4.0 mL乙醇，混合后在517 nm处测定吸光度Aj。再取1.0 mL乙醇，加入4.0 mL DPPH乙醇溶液，混合后在517 nm处测定吸光度 Ac，用公式清除率(%)=［1－ (Ai－Aj)/Ac］ ×100%计算清除率，根据清除率和样品浓度的拟合方程求得IC50值，结果见表3。阳性对照维生素C的IC50值为3.09 μg/mL。

2.5 总黄酮及黄酮苷单体对大鼠红细胞氧化溶血的影响［9］SD大鼠眼眶取血，1000 g离心10 min，分离得到红细胞，生理盐水洗涤3次制成0.5%悬液，取该红细胞悬液1.0 mL，加不同浓度的样品液200 μL，再加100 mmol/L H2O2溶液200 μL混匀。置37℃水浴中保温1 h，用生理盐水稀释10倍，1000 g离心10 min后取上清液于415 nm处比色测定，模型组不加样品，空白组不加H2O2溶液，按公式抑制率(%)= ［1－ (A样品－A空白)/(A模型－A空白)］ ×100% 计算抑制率，根据抑制率和样品浓度的拟合方程求得IC50值，结果见表4。阳性对照维生素C的IC50值为10.55 μg/mL。

表3 总黄酮及黄酮苷单体对DPPH自由基的清除率 (n=3)

表4 总黄酮及黄酮苷单体对大鼠红细胞氧化溶血的抑制率 (n=3)

3 讨论

芦笋中分离得到的5种黄酮苷单体均有较强的体外清除羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基及抑制红细胞氧化溶血的活性。芦笋总黄酮也表现出一定的体外抗氧化活性，但与5种黄酮苷相比，其IC50要高很多，这与芦笋总黄酮中黄酮质量分数 (50%～60%)有关，另外，芦笋黄酮部位中含有的非黄酮类成分可能不具备抗氧化活性甚至具有拮抗效应。

黄酮类主要是通过酚羟基与自由基反应，形成共振稳定的半醌式自由基而中断链式反应的，因此，共振半醌式自由基的稳定性与抗氧化剂活性成正相关。从本实验中5种黄酮苷对·OH的IC50结果来看，抗氧化活性从强到弱依次为芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、水仙苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、烟花苷，这与文献上有关黄酮类化合物抗氧化活性构效关系的分析是基本一致的［10-11］。黄酮化学结构中，B环是抗氧化、清除自由基的主要活性部位，且活性强弱与B环上羟基数目直接相关，随B环上羟基数目的增加而增加。当B环酚羟基数目相同时，含邻二酚羟基的黄酮抗氧化活性明显优于B环含间二酚羟基的黄酮。A环的5，7位酚羟基是高效黄酮类抗氧化剂所必备的，这两处的酚羟基易与过渡金属络合，但7位羟基有较强的酸性，这些都有利于抗氧化活性的提高。C环上的羟基的抗氧化活性则取决于不同的氧化体系。

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