RECK蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其与MMP－9的关系＊

西安交通大学医学院第二附属医院（西安710004）

张 洁 李雅莉 杨 侠 张进召 张秋红 明宗娟 张永红 周淑茹

RECK是一种新的肿瘤转移抑制相关基因，广泛表达于人体的多个组织中，在肿瘤组织中几乎不表达或微量表达，在癌旁正常组织中表达是正常的［1］。国内外研究报道RECK基因有抑制基质金属蛋白酶（MMPs）降解ECM的作用，从而抑制肿瘤的侵袭和转移并改善预后。本研究采用免疫组化法在蛋白水平检测RECK及基质金属蛋白酶－9（MMP－9）在非小细胞肺癌（NSCLC）癌组织及非癌组织中的表达及其相互关系，为RECK在NSCLC的基因治疗提供理论依据。

资料与方法

1 一般资料 NSCLC（鳞癌和腺癌）病例50例，术前均未接受放、化疗及免疫治疗。其中男34例，女16例；年龄34～76岁，中位年龄61岁；肺鳞癌27例，肺腺癌23例；高分化6例，中等分化24例，低分化20例；TNM分期：I期9例，II期16例，III期15例，IV期10例；肺门和（或）纵隔淋巴结及远处转移（简称转移）：有转移31例，无转移19例。另选取20例非癌组织，其中男14例，女6例，年龄42～69岁，中位年龄63．5岁；11例为癌旁正常肺组织，6例为慢性炎症，3例为正常肺组织。

2 方 法 采用免疫组化SP法。鼠抗人RECK mAb多克隆抗体（第一抗体）和兔抗人MMP－9 mAb多克隆抗体（第一抗体）购自美国Santa Cr uz公司；UltraSensitive T MS－P超敏试剂盒，购自福州迈新生物技术开发有限公司。全部标本经甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，切片厚4μm，然后进行免疫组化染色，免疫组化染色过程严格按照说明书进行。两种一抗实际工作浓度1∶100，使用PBS缓冲液（0．01 mol/L，p H＝7．4）代替RECK抗体及 MMP－9抗体作阴性对照，使用已知阳性的食管癌切片做阳性对照。

3 结果判定 根据视野中阳性细胞所占比例作为该切片阳性细胞的百分率进行评分：＜30%为1分，30%～70%为2分，＞70%为3分。以多数呈现的染色特征为计分标准对染色强度进行打分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。最后以阳性细胞百分率计分和染色强度计分相加所得的总分进行结果判定：0～1分为阴性（－），2～3分为弱阳性（＋），≥4分为强阳性（），弱阳性和强阳性统计为阳性。

4 统计学分析 应用SPSS13．0统计软件对实验数据进行处理。用χ2检验、Fisher确切概率法及分类变量的关联性分析（r）等方法，分析免疫组化结果与患者临床特征、病理类型等的关系，α取0．05。

结 果

1 RECK和MMP－9在肺癌组织和非癌组织中的表达 见表1。RECK蛋白阳性表达主要在细胞浆，阳性产物为棕黄色颗粒呈均匀分布。RECK蛋白在癌组织中的阳性表达率为20．0%（10/50），而在非癌组织中的阳性表达率为90．0%（18/20），两者有显著性差异（P＜0．001）。MMP－9蛋白阳性表达主要位于细胞浆，阳性产物为棕黄色颗粒呈均匀分布。MMP－9蛋白在癌组织中的阳性表达率为88．1%（44/50），而在非癌组织中的阳性表达率为15．0%（3/20），两者有显著性差异（P＜0．001）。提示RECK蛋白在癌组织中呈低表达，在非癌组织中呈高表达；而MMP－9蛋白在癌组织中呈高表达，在非癌组织中呈低表达。

表1 RECK和MMP－9蛋白在NSCLC癌组织和非癌组织中的表达

2 RECK和 MMP－9的表达及其NSCLC临床特征的关系 见表2。在肺癌组织中，RECK及MMP－9的表达水平与患者的年龄、性别、是否吸烟及吸烟量、病理类型、分化程度无明显关系（P 均＞0．05），与患者是否有淋巴结转移及TNM分期有关（P均＜0．05）。与无淋巴结转移且TNM分期早期的患者相比，有淋巴结转移和（或）TNM 晚期患者的RECK蛋白表达水平升高，而MMP－9则降低，两者之间有显著的统计学差异（P＜0．001）。

表2 RECK和MMP－9与肺癌临床特征之间的关系

3 RECK和MMP－9蛋白表达在非小细胞肺癌中的关系 在50例标本中，有40例NSCLC患者癌组织RECK蛋白表达阴性而MMP－9蛋白表达阳性；有6例NSCLC患者癌组织RECK蛋白表达阳性而MMP－9蛋白表达阴性。两者经χ2检验及相关性分析，有负相关关系（χ2＝27．273，r＝－0．739，P＜0．001）。

讨 论

RECK基因广泛表达于人体的多个组织中，但在肿瘤组织中几乎是不表达或微量表达的。RECK的mRNA能在非转染的NI H/3 T3细胞中表达，但是在ras转染的NI H3T3细胞中却不表达或表达下降，原癌基因如ras、myc、mos、src等可下调RECK基因的表达［1］，通过抑制RECK基因来实现肿瘤的生长、侵袭和转移。MMPs可释放抑制细胞凋亡的生物活性分子，并通过分解ECM（细胞外基质）来刺激肿瘤细胞的生长和转移［2］。MMPs还可通过促进血管生成，封闭免疫监视，调节免疫应答来促进肿瘤生长［3］。MMPs在人体正常组织中的表达和活性是非常低的，并且是被精细调节的［4］。但当机体处于组织重塑时期或是在病理情况下如癌症时，可迅速诱导MMPs的表达和活性［5］。

RECK基因对MMPs的抑制是一个复杂的多阶段的过程，包括转录水平的抑制，mRNA水平的抑制，蛋白酶的分泌和蛋白酶活性的抑制过程，通过这些复杂的过程，抑制ECM的降解和肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤的侵袭和转移。Taku等［6］发现在RECK基因敲除的小鼠胚胎期，虽然有新生血管形成，但血管的成熟受到明显抑制，组织学检查发现这些变异的胚胎体积小，间充质混乱，缺乏胶原纤维，有异常的组织发生；而恢复RECK基因的表达可抑制肿瘤的侵袭、转移和血管发生。RECK可抑制MMPs，从而抑制肿瘤的进展，并且是一个独立的显著的预后因素，RECK基因表达水平高的患者预后明显好于表达水平低的患者。

本实验结果显示RECK和MMP－9在非癌组织和癌组织中均有表达，RECK在癌组织中的表达水平较非癌组织显著降低，而MMP－9的表达情况则反，差异均有统计学意义（P＜0．001），可推测肺癌组织中RECK基因被抑制，而MMP－9基因被诱导表达增加。RECK及MMP－9蛋白表达和NSCLC患者的性别、年龄及吸烟指数无关，这与Norihiro等［7］及Kazu masa等［8］研究结果相符。这说明虽然肺癌的发生及病理组织类型有性别、年龄的差异，但它们与肺癌的侵袭、转移没有直接的关系；烟草虽然是肺癌最重要的危险因素，但它与RECK和MMP－9蛋白表达水平及调节机制关系甚微。RECK蛋白与 MMP－9蛋白表达与NSCLC的病理类型、分化程度无关，而与TNM分期有密切关系，TNM分期越晚，RECK蛋白表达越低，MMP－9蛋白表达越高，提示 MMP－9可促进NSCLC的侵袭和转移，而RECK基因可抑制NSCLC的侵袭和转移。故MMP－9可作为判断肺癌早期转移的一个指标，而RECK基因可作为判断肺癌预后的一个指标。有淋巴结转移的癌组织中，RECK蛋白表达阳性率明显低于无淋巴结转移者；而 MMP－9蛋白表达阳性率明显高于无淋巴结转移者。提示淋巴结作为局部免疫器官，在NSCLC的转移中发挥了重要作用。

RECK基因与MMP－9之间存在着显著的负相关关系的结果提示，RECK基因可能是 MMP－9的负调节因子，RECK基因通过抑制MMP－9发挥抑癌作用。当NSCLC患者癌组织中的RECK基因被致癌信号下调之后，解除了对MMP－9分泌和活性的抑制，促进了NSCLC的侵袭和转移。基于RECK基因与MMP－9之间的这种负相关关系，可以作为肺癌RECK基因治疗的理论基础，通过上调RECK基因，抑制MMP－9基因的表达，从而达到抑制肺癌的侵袭和转移。

［1］Takahashi C，Sheng Z，Horan TP，et al．Regulation of matrix metalloproteinase 9 and inhibition t u mor invasion by the me mbrane－anehored glycoprotein RECK［J］．Proc Natl Acad Sci，1998，95（11）：13221－13226．

［2］Sternlicht MD，Werb Z．How matrix metalloproteinases regulate cell behavior［J］．Annu Rev Cell Dev Biol，2001，17：463－516．

［3］Overall CM，Lopez－Otin C．Strategies for MMP inhibition in cancer：innovations for the post－trial era［J］．Nat Rev Cancer，2002，2（9）：657－672．

［4］Matrisian L M．Matrix metallopr oteinase gene expression［J］．Ann NY Acad Sci，1994，732：42－50．

［5］Wester marck J，Kahari V M．Regulation of matrix metallo－proteinase expression in tu mor invasion［J］．Faseb J，1999，13（8）：781－792．

［6］Taku T，Miehiyoshi H，Mitsuo N，et al．The membraneanchored matrix metalloproteinase （MMP）regulator RECK in co mbination with MMP－9 serves as an infor mative pr ognostic indicator for colorectal cancer［J］．Clin Cancer Res，2004，10（8）：5572－5579．

［7］Norihiro T，Mitsuhiro T，Yasuhiro H，et al．Low expression of reversion－inducing cysteine－rich protein with Kazal motifs（RECK）indicates a shorte survival after resection in patients with adenocarcino ma of the lung［J］．Lung Cancer，2007，58：376－383．

［8］Kazu masa T，Shinya I，Yozo K，et al．Expression of a novel matrix metalloproteinase regulator，RECK，and its clinical signifi cance in resected non－s mall cell lung cancer［J］．Eur opean Jour nal of Cancer，2004，40：1617－1623．