来曲唑增强环磷酰胺对乳腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用探讨

唐东华 周寿红 王成昆 刘红光

1.湖南环境生物职业技术学院外护教研组，湖南衡阳421001;2.南华大学医学院，湖南衡阳4210013.南华大学附属第一医院肿瘤外科，湖南衡阳 421001

乳腺癌是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一，其治疗方式为手术辅以化疗、放疗。化疗是治疗乳腺癌常用的非手术方法之一，但它有着严重副作用。因此，提高肿瘤细胞对化疗药的敏感性和特异性一直是研究焦点。来曲唑（Letrozol）是第三代非甾体类芳香化酶抑制剂，它能抑制组织中的芳香化酶活性，进而阻止雄激素向雌激素转化，降低血液中雌激素水平，抑制雌激素依赖性癌细胞生长。来曲唑主要用于绝经后晚期乳腺癌，多用于抗雌激素失败后的二线治疗。但是来曲唑与一线抗肿瘤药针对乳腺癌的联用尚未见报道。从2011年11月4日—12月20日，该研究拟采用Balb/c-nu移植瘤模型，评价来曲唑联用环磷酰胺对乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤生长的作用并探讨其机制。

1 资料与方法

1.1 细胞株实验动物、试剂及药品

Balb/c-nu雌性裸鼠40只，6周龄，体重18～20 g，购于中科院上海实验动物中心，SPF级饲养环境由南华大学实验动物部提供。人乳腺癌MDA-MB-231细胞株该研究所保存。来曲唑；环磷酰胺；兔抗人Aromatase、PI3K多克隆抗；免疫组化试剂盒（S-P法），DAB显色剂。

1.2 建立动物模型

将处于对数生长期，汇合度80%～90%的MDA-MB-231乳腺癌细胞瓶内培养基吸弃，用PBS缓冲液洗涤细胞2～3次，胰蛋白酶(0.25%)消化，收集细胞，再次用PBS洗涤，吹打混匀、计数；再以无血清RPMI-1640调整浓度，按每只裸鼠背部皮下接种细胞数1.0×107/0.2 mL细胞悬液注射于裸鼠背部皮下，5～7 d后观察肿瘤移植成功率。

1.3 实验动物分组

取成瘤裸鼠35只，采用随机和均衡原则分成7组 (每组5只)。用药及剂量：①对照组，PBS0.2 mL；②CTX 低剂量组(1 mg/kg)；③CTX高剂量组(40 mg/kg)；④来曲唑低剂量组(1 mg/kg)；⑤来曲唑高剂量组(5 mg/kg)；⑥CTX低剂量组+来曲唑低剂量组；⑦CTX高剂量组+来曲唑低剂量组，各组均采用腹腔注射隔天给药，共8次。末次给药后48 h处死裸鼠，取移植瘤进行。

1.4 观察指标和方法

分别用游标尺测量皮下移植瘤底部Y轴（L）和X轴（W）长度，按公式[V=0.52×L×W2]计算肿瘤体积[1]。 瘤重抑制率(%)=[1-(实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)]×100%。联合用药效果根据公式：Q=Ea+b/[Ea+(1-Ea)×Eb]计算出Q值来判断，Ea和Eb分别为各药单用时的抑制率，Ea+b为两药联用的抑制率，当Q值＞1.15时，说明二药合用有协同作用；当Q值＞0.85且＜1.15时，说明二药联用有相加作用；当Q值＜0.85时，说明两药联用存在拮抗作用。

1.5 免疫组织化学检测

肿瘤标本行常规病理切片，免疫组化染色SP法检测Aromatase、PI3K的表达，用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。结果判别标准：Aromatase以细胞胞浆呈现棕黄色，无明显背景着色，间质干净为合格染色切片；PI3K主要分布于胞浆，结果判断同Aromatase。40倍物镜下观察10个视野内并进行图像采集，继而采用Image Pro6.0软件对图形进行半定量分析：测出图像中呈棕黄色颗粒的面积和吸光度并计算出积分光密度(Integrated Optical Density，IOD)，IOD值越高，说明蛋白表达量越高。

1.6 统计方法

计量资料数据以S.D表示，采用SPSS15.0软件，单因素方差分析(One-way ANOVA)进行样本均数多组别比较。

2 结果

2.1 裸鼠成瘤情况

自接种后7 d开始，瘤细胞接种部位皮下可见小结节，约5 mm×5 mm大小；至第10天，肿瘤约7 mm×7 mm大小。共有38只裸鼠成瘤，成瘤率为95%。

2.2 移植瘤的病理学观察

实验结束后剥取移植瘤，每个瘤组织切取部分进行常规病理切片，H.E染色。镜下可见癌组织被纤维间质分隔成大小不等的癌巢，可见腺腔、腺管样结构；癌细胞大小不等，呈圆形或椭圆形；核大，核仁明显，可见病理性核分裂像，胞浆微嗜碱半透明。

2.3 各组裸鼠皮下移植瘤生长情况

各实验组瘤体积及瘤重明显低于对照组(P<0.01)，来曲唑低剂量组与CTX低剂量和CTX高剂量组两个联用组抑瘤作用进一步增强，抑瘤率分别为60.9%，80.95%，两种药物合用显示出明显的协同作用，Q值分别为1.142和1.221。结果见图1，表1。

图1 裸鼠移植瘤体积生长曲线

表1 各组移植瘤瘤重抑制率及Q值

2.4 各组裸鼠对化疗的毒性反应

实验期间，CTX高剂量组小鼠逐渐出现活动减少、精神萎靡、食量及体重下降等表现，其余各组裸鼠未见明显不良反应。

2.5 来曲唑、环磷酰胺对肿瘤细胞Aromatase、PI3K蛋白表达的影响

免疫组织化学检测结果：与阴性对照组比较，Aromatase和PI3K表达在来曲唑组中均下调，差异有统计学意义(P<0.05)，在联合用药组中差异有统计学意义(P<0.01)。见表2，图2。

3 讨论

乳腺癌是女性排名第一的常见恶性肿瘤。在我国北京、上海、天津等大城市的统计显示乳腺癌同样是我国女性最常见的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势。烷化剂类药物是乳腺癌化疗方案中较常用药物，环磷酰胺是乳腺癌联合化疗的一线用药，但其毒副作用却较为严重。近期研究表明来曲唑有可能增强化疗药物对肿瘤细胞的抑制作用[2-4]。该研究也发现：除来曲唑单用组外，各用药组中移植瘤的生长均被不同程度抑制，而联合用药对肿瘤抑制作用更明显 (P<0.01)。第⑥和⑦实验组Q值均＞1.15，说明来曲唑对环磷酰胺有确切增效作用。在实验过程中，环磷酰胺高剂量组裸鼠不良反应严重，也与临床患者的不良反应相吻合，与大剂量用药的毒副作用有关。而其余实验组裸鼠均未出现明显不良反应，说明来曲唑能有效增加环磷酰胺的药效并降低其毒副作用。

表2 Aromatase和PI3K在移植瘤内表达的积分光密度值（IOD）(S.D)

图2 免疫组织化学法检测Aromatase和PI3K的表达 (S-P×400)

芳香化酶是属于细胞色素P450超家族，是体内合成雌激素的关键酶。它可脱去雄激素的19-甲基，芳构A环而转化成C18雌激素(雌酮和雌二醇)。来曲唑是第三代芳香化酶抑制剂，可有效抑制芳香化酶合成雌激素[5]。雌激素在体内与雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)结合，发挥多效复杂的生物学效应。雌激素受体可位于细胞膜、细胞质或细胞核。经典的核受体位于细胞核，扩散到细胞核的雌激素与其核受体结合后引发基因调控机制，调节下游基因的转录。ER介导的信号转导途径包括PI3K/Akt信号转导途径和MAPK/ERK信号转导途径，其中PI3K/Akt对于肿瘤细胞生长增殖和抑制凋亡有重要作用。PI3K活化信号有助于细胞增殖并能抑制凋亡，有助于肿瘤生长。许多实体肿瘤中都发现PI3K的过表达，如肺癌[6]、鼻咽癌[7]、等前列腺癌[8]。抑制PI3K的表达同样能增强MDA-MB-231细胞对环磷酰胺的敏感性[9]，抑制MDA-MB-231细胞的增殖并诱导其凋亡[10-11]。

该研究应用免疫组化发现在人乳腺癌裸鼠移植瘤中芳香化酶表达较高。在来曲唑组和联合用药组中，Aromatase及PI3K的表达均被不同程度抑制。两种剂量来曲唑与低剂量环磷酰胺组联用后，对移植瘤的生长抑制作用较单独用药组明显增强。说明来曲唑与环磷酰胺联用具有协同增效作用，其机制可能是来曲唑通过抑制Aromatase与PI3K的表达，弱化肿瘤细胞增殖信号，从而增强环磷酰胺对乳腺癌细胞的有效性，提示来曲唑有望成为一种乳腺癌化疗增敏剂，但其对化疗药物的增敏机制仍有待深入探讨。

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