EMMPRIN 基因表达对胶质瘤U251 细胞增殖、凋亡的影响

徐利民，陆永建，柳浩然

胶质瘤是中枢系统最常见的恶性肿瘤。目前手术治疗无法根治，常规的放疗及化疗效果均较差，临床预后差。基质金属蛋白酶介导的组织内基底膜的降解在肿瘤的生长、血管形成、局部侵袭和远处转移中发挥重要作用，肿瘤细胞产生的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子，诱导邻近的成纤维细胞产生基质金属蛋白酶，是促进肿瘤的侵袭和转移的关键步骤。目前国内外尚未见以EMMPRIN 基因为靶点治疗脑胶质瘤的相关报道。本研究旨在探讨EMMPRIN 基因表达与脑胶质瘤细胞增殖、凋亡的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 人胶质瘤U251 细胞株为本实验室传代保存，转染试剂LipofectameTM2000、Rabbit anti－EMMPRIN 购自美国Invitrogen 公司，RT－PCR 试剂盒购自日本Takara 公司，MTT 及PI 均购自美国Sigma 公司，siRNA－EMMPRIN 及阴性对照siRNA－negtive 购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 化学合成siRNA－EMMPRIN 及阴性对照siRNA－negtive 片段 由上海吉玛制药技术有限公司合成的两对siRNA－EMMPRIN 序列以及阴性对照siRNA－negtive 片段序列如下:

siRNA－negative control 序列，Sense:5－UUCUCCGAACGUGUCUTT－3;Antisense:5－ACGUGACACGUUCGGAGGATT－3。siRNA－EMMPRIN－1序列，Sense:5－GUUGAUGUGUUCUGACGAC dTdT－ 3;Antisense:5－GUCGUCAGAACACAUCAACTT－ 3。siRNA－EMMPRIN－2 序列，Sense:5－GACGUUCUUGCCUUUGUCA dTdT－3;Antisense:5－UGACAAAGGCAACGUCTT－3。

1.2.2 逆转录酶－多聚酶链反应(RT－PCR)检测EMMPRIN 基因mRNA 表达水平 本实验分为3组:siRNA－negative control 序列转染组为阴性对照组，siRNA－EMMPRIN－ 1 序列转染组为实验组1，siRNA－EMMPRIN－ 2 序列转染组为实验组2，按Trizol 试剂盒说明书分别提取转染48 h 后上述三组细胞的总RNA。RT－PCR 反应参照RT－PCR 试剂盒说明书进行操作，引物由英骏生物技术有限公司合成，EMMPRIN 基因引物序列如下。

Forward primer:5'－CTCTGAGGACAAGGCCCTCATGAAC－3';Reverse primer:5'－CCGGCGCTTCTCGTAGATGAAGATG－3';扩增片段长度268 bp，Tm:60 ℃。

人内参GAPDH 引物序列如下:Forward primer:5'－GCCACATCGCTCAGACAC－3';Reverse primer:5'－CATCACGCCACAGTTTCC－3';扩增片段长度614 bp，Tm:59 ℃。

PCR 反应结束，取10 μl PCR 产物与上样缓冲液混匀，加入2% 的琼脂糖凝胶梳孔行电泳。取DNA marker 进行电泳，作为标准分子量的参照。80 V 恒定电压下行电泳45 min 后，将凝胶电泳置入凝胶分析仪暗箱中拍摄凝胶电泳图像。

1.2.3 Western blot 检测EMMPRIN 的表达 分别收集转染后48 h 的siRNA－negative control 序列转染组，siRNA－EMMPRIN－1 序列转染组，siRNA－EMMPRIN－ 2 序列转染组细胞，用4 ℃预冷的PBS漂洗3 次后加入200 μl 细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白，每个样本有效超声3 次后，加入5 ×SDS 凝胶加样缓冲液，沸水浴5 min，每孔加样20 μl 行12%十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用半干法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜用5%脱脂奶封闭1 h 加入一抗，4 ℃过夜，加入二抗室温下孵育1 h，化学法发光，胶片显色，分析结果。以tubulin 作为内参照。

1.2.4 甲基噻唑基四唑法(MTT 法)检测细胞增殖 U251 细胞消化制成单细胞悬液，以含10% FBS的DMEM 培养液调整浓度至(1 ～5)×105个/ml，取上述细胞悬液200 μl 至96 孔细胞培养板中培养12 h 后，进行小分子干扰片段转染，每组设6 个复孔。96 孔细胞培养板周围32 个孔舍弃，不加试剂。6 h 后更换10% FBS 的DMEM 培养液，37°C，5%(v/v)CO2饱和湿度恒温培养箱中培养。倒置显微镜下观察细胞形态。分别于培养12、24、48 h 后，吸干培养液，以PBS 漂洗2 遍后，每个孔中加入5mg/ml 的MTT 20 μl，同样条件下培养4 h 后吸干，可见黑色结晶，终止培养。再于每个孔中加入200 μl 的DMSO，避光振荡溶解10 min，并设定空白对照孔，调零，酶标仪检测波长490nm 时各孔的吸光值(A490)。

1.2.5 流式细胞技术(FCM)检测细胞周期 收集转染48 h 后6 孔培养板中的siRNA－negative control 序列转染组，siRNA－EMMPRIN－1 序列转染组，siRNA－EMMPRIN－ 2 序列转染组细胞，制成单细胞悬液，调整细胞至(1 ～5)×106个/ml。加入3 ml 预冷的PBS 重悬细胞，800 r/min ×5 min，吸净上清。加入500μl PBS，轻轻重悬细胞，使细胞分离为单个，逐滴加入预冷的100%乙醇(－20℃)1.5 ml，使其终浓度为75%，－20 ℃放置过夜固定。取出固定样本，800 r/min×5 min，弃上清。加入3 ml 预冷的PBS 重悬细胞，800 r/min×5 min，离心收集细胞，除去乙醇。加入150 μl RNaseA 重悬细胞，室温静置10 min，加入150 μl PI 工作液，4℃避光染色30 min。转至流式检测管:上机检测，PI 用488 nm 氩离子激光器激发，由630 带通滤光片接收，通过FSC/SSC 散点图收集10 000 个细胞，采用设门技术排除粘连细胞和碎片，分析PI 荧光直方图上细胞各周期及凋亡细胞的百分率。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0 统计软件包进行分析处理。多组间比较采用单因素方差分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EMMPRIN－siRNA 小片段转染U251 细胞后EMMPRIN 基因mRNA 及蛋白的表达 如图1 与图2 中结果显示，转染EMMPRIN－siRNA 小分子干扰片段后，相对于阴性对照组，实验组1 和实验组2 中U251 细胞EMMPRIN 基因的mRNA 及蛋白表达均显著下调。

2.2 EMMPRIN 基因表达下调导致U251 细胞增殖抑制 在转染EMMPRIN－siRNA 小分子干扰片段12 h，24 h 及48 h 后，实验组1、实验组2 与阴性对照组相比细胞增殖明显受到抑制(P ＜0.05，表1)。

表1 各组U251 细胞MTT 检测结果(n=5;±s)

表1 各组U251 细胞MTT 检测结果(n=5;±s)

注:各时间点MTT 检测结果与阴性对照组相比，①P ＜0.05

时间点阴性对照组实验组1实验组2 12 h0.1176±0.011 0.1061±0.008① 0.1022±0.013①24 h0.5913±0.009 0.3902±0.012① 0.3889±0.011①48 h0.8861±0.013 0.5838±0.011① 0.5756±0.012①

2.3 EMMPRIN 基因表达下调导致U251 细胞凋亡增加 EMMPRIN－siRNA 转染U251 细胞，实验组1细胞的凋亡率为(6.0 ±0.7)%，实验组2 细胞的凋亡率为(6.4 ±1.0)%，阴性对照组细胞的凋亡率为(2.7 ±0.6)%，实验组1、实验组2 细胞的凋亡率与阴性对照组细胞的凋亡率相比明显升高(P ＜0.05)，差异有统计学意义。

2.4 EMMPRIN 基因表达下调对U251 细胞的细胞周期分布的影响 如前述方法将EMMPRIN－siRNA 小分子干扰片段转染U251 细胞，在转染48 h 后进行PI 染色，流式细胞仪检测细胞周期分布情况。结果显示:EMMPRIN－siRNA 转染U251 细胞，细胞的周期分布发生显著变化，实验组1、实验组2 和阴性对照组细胞S 期细胞比例分别为(28.1 ±2.6)%，(29.1 ±2.9)%，(45.1 ±3.1)%，经过统计学分析实验组1、实验组2 细胞的S 期细胞比例与阴性对照组细胞的S 期细胞比例相比明显降低(P ＜0.05)，差异有统计学意义。

3 讨论

EMMPRIN 是免疫球蛋白超家族中的一个成员，正常时仅在有限的几种细胞(上皮细胞、生殖细胞、左心室心肌细胞、脑血管内皮细胞［1］)表达，而在肿瘤组织中广泛的高表达。在正常生理条件下，EMMPRIN 参与创伤愈合、组织修复、妊娠和胚胎发育等众多的生理过程。同时，EMMPRIN 基因表达对于肿瘤细胞的增殖、肿瘤血管的形成和化疗抵抗均起到重要作用。Sameshima 等［2］对人脑胶质瘤与EMMRPIN 基因关系的研究显示，与正常脑组织相比，EMMPRIN 基因在人脑胶质瘤中高表达，并且与肿瘤的恶性程度成正相关，EMMPRIN 基因在胶质瘤的发生，发展过程中起重要的作用。

Zucker 等［3］研究发现，通过转染EMMPRIN 的cDNA 到乳腺癌细胞MDA－MB436 中后，细胞在裸鼠体内的增殖能力迅速提高，其机制在于EMMPRIN介导的MMP－2 和MMP－9 的生成，加速降解细胞外基质而使肿瘤细胞生长加速。Han 等［4］通过RNA 干扰沉默人前列腺癌细胞和人膀胱癌细胞EMMPRIN 表达，发现上述细胞的体内生长和增殖能力明显降低。本实验结果显示，下调U251 细胞中EMMPRIN 的表达能够有效抑制细胞的增殖，首次证实了EMMPRIN 基因在胶质瘤中也是起到促进肿瘤细胞增殖的作用，与在其他恶性肿瘤中作用一致。笔者通过流式细胞技术检测细胞周期，发现下调U251 细胞中EMMPRIN 基因的表达使细胞周期分布发生改变，S 期细胞比例显著减少，使细胞有丝分裂减少，从而抑制细胞的增殖。这说明下调EMMPRIN 基因的表达可能是通过影响细胞有丝分裂从而抑制细胞增殖。Tang 等［5］研究发现，EMMPRIN 在乳腺癌中促进肿瘤细胞增殖的机制在于EMMPRIN 介导的MMP－2 和MMP－9 的生成，加速降解细胞外基质而使肿瘤细胞生长加速。Baba等［6］研究证实，通过抑制EMMPRIN 的表达影响肿瘤细胞的能量代谢，从而抑制肿瘤的增殖。Xiang等［7］的研究证实，EMMPRIN 基因表达下调能够有效抑制恶性黑色素瘤细胞在体外和裸鼠体内的增殖，认为可能的机制是EMMPRIN 基因表达下调能够有效抑制VEGF 的表达，使肿瘤的生长受到抑制。笔者考虑EMMPRIN 基因促进胶质瘤细胞增殖可能也是依靠上述机制。

Marrieb［8］在对EMMPRIN 与乳腺癌系细胞株凋亡的关系研究中发现:将EMMRPIN 基因导入到肿瘤细胞中，肿瘤细胞凋亡明显减少，其机制是EMMPRIN 主要是促进肿瘤细胞的锚着非依赖性生长，从而对抗细胞失巢凋亡。并且肿瘤细胞这种锚着非依赖性生长是与P13K 与ErK 两种细胞存活信号通路的活化是密切相关的。本实验结果显示，下调人脑胶质瘤U251 细胞株中EMMPRIN 基因的表达，能导致细胞凋亡率明显升高，与在乳腺癌等其他恶性肿瘤中所得结果一致。结合EMMPRIN 基因在其他恶性肿瘤中对抗细胞凋亡的机制研究结果，笔者考虑EMMPRIN 基因在胶质瘤中可能也是通过某种细胞存活信号通路的活化对抗细胞凋亡，其具体机制有待进一步研究。

胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，临床早期诊断和预防困难，治疗棘手，同时致残率、病死率均极高。胶质瘤发生发展的具体机制未完全阐明是造成这一局面的主要原因。研究表明，分子遗传学在胶质瘤发生、发展中起着巨大的作用。本实验以EMMPRIN 基因为靶点，以人脑胶质瘤U251 细胞为研究对象，通过RNAi 技术，探讨EMMPRIN 基因表达对人脑胶质瘤U251 细胞增殖、凋亡的相关性，为以EMMPRIN 基因为靶点的基因治疗提供了理论基础和实验依据，为人脑胶质瘤的治疗开辟了新的途径。但EMMPRIN 基因在促进胶质瘤增殖，对抗细胞凋亡的具体机制有待进一步研究。

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