脂血和溶血对HBV DNA 实时荧光定量PCR 检测的影响

张翠莉，刘 萍，魏文波

临床标本不仅种类多样，如血清、血浆、脓液、脑脊液、痰、分泌物等，并且同类型标本也可有不同的性质，如血清标本会有不同程度的溶血、脂血标本等。笔者利用实时荧光定量PCR 方法检测不同程度脂血、溶血标本中乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)的结果，并进行统计学分析，以研究脂血、溶血是否影响荧光定量PCR 扩增HBV DNA 结果。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 荧光定量PCR 仪(型号:DA7600，中山大学达安基因股份有限公司);HBV DNA 试剂(达安基因有限公司，批号2010004);日立7180 全自动生化仪;紫外可见分光光度计;三酰甘油(triglyceride，TG)生化试剂(浙江伊利康生物技术有限公司，批号为20100105)。

1.2 标本采集

1.2.1 研究乳糜状脂血因素实验的标本收集 收集武警四川总队医院2010－04 至2010－05 血脂正常、无溶血的HBV DNA 血标本共30 例，每例采集血液3 ml。根据HBV DNA 浓度将所收集的30 例标本分为两个水平:中高HBV DNA 浓度，即HBV DNA≥1.0 ×105标本15 例，设定为Ⅰ水平;HBV DNA 临界浓度1.0 ×103至1.0 ×104标本15 例，设定为Ⅱ水平。收集乙肝表面抗体(HBsAb)阳性或两对半全阴性、肝功能正常、无溶血的重度乳糜状脂血标本及正常人血清标本各5 例，每例采集血液3 ml，及时分离血清，－20 ℃保存。

1.2.2 研究溶血因素实验的标本收集 收集临床乙肝患者无脂血、无黄疸血标本30 例，每人同时采集3 管，每管3 ml，其中两管－20 ℃冷冻不同时间致不同程度溶血［1］，留做平行实验。

1.3 方法

1.3.1 实验设计 设计不同血脂(三酰甘油)浓度和不同溶血程度的标本，并研究两种因素对荧光定量PCR 测定两个水平HBV DNA 结果是否有影响。

1.3.2 标本制作

1.3.2.1 两种水平HBV DNA 不同TG 浓度标本的制作 (1)按照HBV DNA 浓度将临床收集的标本分为两个水平，分别为中高浓度HBV DNA≥1.0×10515 份(Ⅰ水平);临界浓度，HBV DNA 介于1.0 ×103～1.0 ×10415 份(Ⅱ水平)。(2)按照美国国家胆固醇教育计划的成人治疗专家组Ⅲ(NCEPATP Ⅲ)血脂标准，结合本实验，制作3 种TG 浓度梯度标本，极高TG 浓度脂血(TG≥5.64 mmol/L，A组)、高TG 浓度(TG 2.26 ～5.63 mmol/L，B 组)及正常血脂浓度标本(C 组)。(3)将所收集的重度乳糜状的脂血标本混匀，进行TG 检测，TG 为13.88 mmol/L;(4)HBV DNAⅠ水平不同浓度TG 标本的制作:AⅠ组:重度乳糜状标本∶正常人血清∶HBV DNAⅠ水平 =1∶0∶1。BⅠ组:重度乳糜状标本∶正常人血清:HBV DNAⅠ水平 =0.5∶0.5∶1。CⅠ组:重度乳糜状标本∶正常人血清∶HBV DNAⅠ水平 =0∶1∶1。(5)HBV DNAⅡ水平不同浓度TG 标本的制作:AⅡ组:重度乳糜状标本∶正常人血清∶HBV DNAⅡ水平 =1∶0∶1。BⅡ组:重度乳糜状标本∶正常人血清∶HBV DNAⅡ水平=0.5∶0.5∶1。CⅡ组:重度乳糜状标本∶正常人血清∶HBV DNAⅡ水平 =0∶1∶1。

1.3.2.2 两种水平HBV DNA 不同溶血程度标本制作 采用－20 ℃冰箱冷冻不同时间，导致标本不同程度溶血，利用分光光度计氰化高铁血红蛋白测定法，检测血红蛋白浓度，从而将溶血标本分为重度溶血组(血红蛋白＞5.0 g/L，D 组)、轻中度溶血组(0.8g/L ＜血红蛋白＜5.0 g/L，E 组)［1］、无溶血组(F 组)。(1)HBV DNAⅠ水平3 种溶血标本，即:DⅠ组、EⅠ组、FⅠ组;(2)HBV DNAⅡ水平3 种溶血标本，即:DⅡ组、EⅡ组、FⅡ组。

1.3.3 HBV DNA 提取和检测 参照达安基因公司试剂盒说明书进行，待测标本与室内质控标本同时进行检测。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0 软件对数据进行统计学分析，对三组标本PCR 结果取对数(Log10)进行数据转换，其结果符合正态分布，对三组数据进行方差齐性检验，结果方差齐同。对三组数据进行F 检验。

2 结果

2.1 不同TG 浓度对HBV DNA 实时荧光定量PCR结果的影响 ABC 三组不同TG 浓度对HBV DNAⅠ、Ⅱ水平实时荧光定量PCR 扩增结果均无影响(P ＞0.05，表1)。

表1 不同TG 浓度对HBV DNA 荧光定量扩增结果的影响(±s，U/ml)

表1 不同TG 浓度对HBV DNA 荧光定量扩增结果的影响(±s，U/ml)

分组例数(n)HBV DNA 水平组ⅠⅡA156.26±0.913.12±0.71 B156.28±0.882.98±0.80 C156.57±0.983.09±0.69

2.2 不同溶血程度对HBV DNA 实时荧光定量PCR 结果的影响 在HBV DNAⅠ水平和Ⅱ水平中，不同程度的溶血对PCR 扩增结果均无影响(P ＞0.05，表2)。

表2 不同程度溶血对HBV DNA 荧光定量扩增结果的影响(±s，U/ml)

表2 不同程度溶血对HBV DNA 荧光定量扩增结果的影响(±s，U/ml)

分组例数(n)HBV DNA 水平组ⅠⅡD156.13±0.893.35±0.80 E156.21±0.913.48±0.75 F156.17±0.933.43±0.78

3 讨论

PCR 技术由于其极高的检测灵敏度和特异性，在临床疾病诊断和疗效观察上得到了广泛的应用，大大提高了疾病诊断的准确性和快速性。荧光定量PCR 所采用的UNG 防污染技术和荧光探针标记闭管检测技术也有效控制了假阳性的发生。尽管如此，由于临床标本的多样性，比如溶血、脂血、药物等因素的存在，可能造成荧光定量PCR 检测结果假阴性发生。有研究表明，溶血标本因其血红素及代谢产物的残留抑制了DNA 聚合酶，会降低荧光定量PCR 结果，甚至出现假阴性［2，3］。黄其俊和吴坚敏［4］的研究表明，溶血程度不同对HBV DNA 定量结果的影响不同，即Hb ＞5.0 g/L 的重度溶血标本会导致HBV DNA 荧光定量PCR 检测结果降低，而轻度溶血标本对HBV DNA 实时荧光定量结果的影响无显著性差异。对于脂血是否影响荧光定量PCR 检测结果的研究也存在矛盾之处。文献［5，6］认为，脂血会降低HBV DNA 检测结果，并且随着TG 水平的增高，对HBV DNA 结果影响越大。李小宁等［7］研究表明，高TG 乳糜状血清不会对HBV DNA≥1.0 ×105的检测结果产生影响。

本研究结果表明，无论溶血程度如何，无论HBV DNA 浓度如何，溶血对HBV DNA 实时荧光定量PCR 检测结果的影响都无显著性差异，且高血脂不仅不会影响中高浓度HBV DNA 检测结果，对临界浓度HBV DNA 结果的影响差异亦无统计学意义(P ＞0.05)。本研究还对HBV DNA 浓度＜1.0 ×103的标本进行了脂血和溶血因素的研究，检测结果也100%符合，表明脂血和溶血不会导致假阳性结果产生。

本实验在提取核酸过程中，血红蛋白能被有效地去除，故得出了血红蛋白对荧光定量PCR 检测HBV DNA 没有差异性影响的结果，不同的血脂浓度对检测结果的影响差异也无统计学意义(P ＞0.05)。对于与黄其俊等［4］研究结果的矛盾，可能是由于实验设计和统计学处理的不同所导致。本研究设计的各溶血组(D、E 组)与对照组(F)均采用同一患者同时采集的样本进行，使得整个实验更具有可比性，结果更具有说服力。在脂血是否影响实时荧光定量PCR 检测HBV DNA 研究上，本研究结果与高峰等［5］的研究结果有差异，分析其原因可能是:(1)试剂灵敏度和特异性的差异;(2)统计学分析时所采用的标准及方法不同所造成。实验本研究结果在同李小宁等［7］研究结果一致的同时，本研究还从HBV DNA 临界值水平进行了脂血对荧光定量PCR 方法是否具有影响的研究。从本研究所得出的结论可以看出，高血脂乳糜状标本不会影响荧光定量PCR 方法检测HBV DNA。

［1］ 董振南，高 静. 不同程度溶血对常规生化检验结果影响的探讨［J］. 军医进修学院学报，2005，26 (5):329－331.

［2］ Akane A，Matsubara K，Nakamura H，et al. Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid(DNA)from Bloodstains，a major inhibitor of polymerase chain reaction(PCR)amplification［J］. J Forensic Sci，1994，39(2):362－372.

［3］ 陈英剑，胡成进，齐发莲，等. 溶血对荧光定量PCR检测HBV DNA 结果的影响［J］. 国外医学临床生化与检验学分册，2004，25(6):563－564.

［4］ 黄其俊，吴坚敏. 不同程度溶血对荧光定量PCR 检测HBV DNA 结果的影响［J］. 实验与检验医学，2008，26 (2):211－213.

［5］ 高 峰，高慧华，杨学文. 脂血因素对荧光定量PCR检测乙肝病毒DNA 的影响及解决措施［J］. 临床检验杂志，2007，25(5):359－360.

［6］ 朱艳华，张慧敏. 脂血对检测HBV DNA 的影响及解决办法［J］. 内蒙古医学杂志，2009，10:1214－1215.

［7］ 李小宁，黄升海. 脂血标本对HBV DNA 定量检测结果的影响［J］. 皖南医学院学报，2007，26(4):285－286.