磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)影响转化生长因子(TGF-β1)促肺纤维化形成的研究

刘 旭

(咸宁卫校附属医院，湖北 咸宁 437100)

多数研究报道［1，2］，在众多致纤维化细胞因子中，转化生长因子β-1(TGF-β1)是公认最重要的调控因子。TGF-β1可促进肺成纤维细胞(FB)过度增殖、分化，继而促进胶原蛋白等细胞外基质(ECM)在肺间质和肺泡间过度积聚，导致肺纤维化的发生和发展。PI3K/AKT是人体细胞生长发育的重要信号调节机制。它介导参与细胞生长、发育、分裂、分化、死亡，甚至细胞间功能同步等多种细胞过程。PI3K信号通路主要由激活粘附斑激酶(FAK)、PI3K、Akt等构成，它们通过调节整合素等信号转导，而产生一系列的细胞增殖、迁移和粘附等功能，甚至能够增加I型胶原蛋白的表达。近来研究表明［3］:TGF-β1可以激活 PI3K 信号途径，并且通过该信号通路对细胞增殖、迁移、分泌产生影响。目前，TGF-β1与PI3K信号通路的关系如何影响肺纤维化具体机制尚不清楚，本研究即针对该机制在肺纤维化过程中的影响进行探讨。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器

健康雌性6周龄KM小鼠88只，体质量(20±2)g，购自江苏大学实验动物中心。盐酸博来霉素(BLM)粉剂购自日本花药株式会社;PI3K抑制剂 LY294002，特异性抗体 anti-PI3K/P85alpha，TGF-β1 特异性抑制剂 SB-431542，TGF-β1 购自Santa Cruz公司;人胚肺成纤维细胞(HELF)系HFL-I细胞株(中科院细胞库)。

1.2 实验方法

1.2.1 PF 制备模型及分组

将88只小鼠随即分为实验组76只(随即分为TGF-β1亚组、LY294002亚组，各28只，对照亚组20只)、空白组12只。造模方法参照文献，气管内注射BLM3.5mg/kg，空白组同法经气管内注入相应体积的生理盐水。TGF-β1亚组为:联合TGF-β1+SB-431542 组，单纯 TGF-β1 组，随机各14只;LY294002亚组为:联合 TGF-β1+LY294002组，随机各14只;对照亚组为:相同体积盐水，其中 TGF-β1，SB-431542，LY294002 浓度为我们预实验总结数据，即 TGF-β1:100pmol/L，SB-431542:100mmol/L，LY294002:15μmol/L。造模后第3、7、14、28d分别处死4组小鼠各3只，取出并分离其肺组织备用。

1.2.2 肺组织的处理

氯氨酮腹腔注射麻醉后无菌开胸，于右心室插入套管针，拔去针头，左心耳剪一3mm左右切口，同时套管与输液器相连，向右心室灌注加入肝素的生理盐水，直至肺脏发白，血管冲洗干净;分离左肺下叶，注入4%多聚甲醛2ml见胸膜展平;结扎气管后固定。常规酒精梯度脱水，石蜡包埋，切片，片厚5μm;用37℃生理盐水灌洗右肺6次，回收灌洗液。经无数纱布滤过后，放入无菌离心管中，经离心、甩片及HE染色;余组织－80℃冻存。用于Western-blot及应用氯氨T氧化-比色法检测羟脯氨酸(HYP)。

1.2.3 免疫组织化学法

通过免疫组织化学法检测 TGF-β1亚组、LY294002亚组、对照亚组、空白组PI3K蛋白的表达，Anti-PI3K/P85:1∶150。应用双盲法进行评估，SABC染色法(×100)，结果以棕黄色连续或灶性颗粒分布为表达阳性，在显微镜下随机选择10个高倍镜(400×)视野计数，每个区域计数100个，共1000个细胞，计算出阳性细胞的百分数。根据染色强度着色细胞百分数积分之积判断结果，即:≤4分为(－);＞4且≤8为(+);＞8且≤12为(++);＞12且≤16为(+++)。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 肺组织病理学检查

博来霉素注射后3d，HE染色(×40)，实验组各组小鼠肺小血管扩张、充血、肺泡腔内出现红细胞及炎性细胞，肺间质内细胞增多，空白组小鼠无明显变化。7d后，单纯TGF-β1，对照组，两组小鼠肺间隔轻中度间质细胞增多及胶原样物质明显增生，肺组织结构紊乱;联合 TGF-β1+SB-431542组，联合TGF-β1+LY294002组两组胶原物质继续增生，空白组无明显变化。14～28d，单纯TGF-β1组肺间隔明显增宽，肺泡间隔内成纤维细胞及胶原样物质明显增多，肺泡结构紊乱、萎陷;联合TGF-β1+SB-431542 组，联合 TGF-β1+LY294002组，对照组三组小鼠肺泡间隔继续增宽，空白组变化不明显。单纯TGF-β1组，羟脯氨酸(HYP)量明显高于其他两实验组及对照组(P＜0.01);联合F-β1+SB-431542、TGF-β1+LY294002 组及对照组明显高于空白组(P＜0.05)。

2.2 TGF-β1 亚组、LY294002 亚组、对照亚组、空白组PI3K蛋白表达

PI3K主要分布在细胞核外，呈棕黄色(图1)，经分析可知，TGF-β1组PI3K表达明显高于其余3组，同时TGF-β1+LY294002组亦高于空白组，并且对照组也高于空白组。

图1 免疫组化观察PI3K表达及分布(SABC×100)

3 讨论

近年来［4～6］，许多研究发现肺纤维化疾病越来越成为威胁人们身体健康的重要疾病之一，国内外关于肺纤维化发展机制的研究也一直比较热门。较为认可的观点是:肺成纤维细胞是肺纤维化发展过程中的主要效应细胞，其承担着合成和分泌细胞外基质，同时肺纤维化过程以过度增生、合成胶原增多为主要特征。有研究证实:TGF-β1是促成成纤维细胞形成的关键因子，是胶原合成最直接和有效的刺激剂。甚至有报道称:肺内高浓度TGF-β1会导致肺组织细胞外基质沉积显著增加。目前关于TGF-β1促成肺成纤维化细胞激活的具体机制了解仍然不够透彻，但有研究报道，其可能与Smad家族的信号通路转导有关，并且受到多种细胞因子、生长因子等调控，如PI3K等。

PI3K已发现可参与多种信号通路［6～8］，调节细胞各种功能。被激活时可作为第二信使结合并激活多种细胞内靶蛋白，组成一个信号级联系统。近年来，关于PI3K信号系统在肺相关疾病发展过程中的研究较热，主要发现其是多种生长因子信号途径关键分子，多种生长因子通过它调控细胞增殖、凋亡、分泌、合成等。

本研究以TGF-β1与细胞质内信号通路重要信号分子PI3K关系为研究对象，通过构建小鼠肺纤维化模型，探讨TGF-β1通过PI3K调控肺纤维化进展的可能机制。

研究发现，利用博来霉素能够成功构建小鼠肺纤维化模型，分析发现，实验组肺纤维化发展过程呈现出典型的疾病过程，早期以肺泡炎症为主，炎性细胞侵润，继而多形核白细胞、单核/巨核细胞等侵润，肺泡间隔增宽，肺组织结构受损，为典型肺泡炎期;7～14d期间，实验组肺纤维组织增生，尤其 TGF-β1 最为明显，TGF-β1+LY294002组肺纤维组织相对较少;28d时，TGF-β1组，小鼠稳定肺纤维化形成，肺结构完全紊乱，炎性细胞明显减少;而TGF-β1+LY294002组，小鼠炎性细胞依然较多，肺结构依然较清晰，但肺纤维化组织继续增多。通过分析对比各组羟脯氨酸(HYP)量的变化，也证实我们病理观察结果，于14～28d期间，TGF-β1 组明显高于 TGF-β1+LY294002 组，并且两者都显著高于空白组(P＜0.05)。

结论提示:TGF-β1是肺纤维化进展过程中重要的因素，这与多数研究报道相符，同时，我们发现PI3K可能可以影响TGF-β1促肺纤维化形成的进程，其可能是TGF-β1促肺纤维化形成的重要机制之一。

在随后我们的分析中发现，相对对照组，空白组、实验各组PI3K明显高表达，表明PI3K参与肺纤维化形成，是肺纤维化进展过程中重要的因素，同时通过分析 TGF-β1组与 TGF-β1+LY294002组，发现无论病理结果抑或HYP量的变化，后者都明显下降，在肺纤维化中后期表现尤为明显［8～10］，这说明抑制 PI3K 可以影响肺纤维化发展，阻碍 TGF-β1促肺纤维化形成，提示 PI3K是TGF-β1促肺纤维化形成机制的重要信号分子。肺纤维化是一种慢性进行性疾病，其病因复杂，发病机理尚不十分清楚，探讨阐述其发病机制迫在眉睫。本研究通过对PI3K与TGF-β1在肺纤维化过程中作用进行研究，部分地阐述了生长因子影响肺纤维化的机制，为人们开展控制和治疗肺纤维化疾病提供了重要理论依据。

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