丹参注射液对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏脂质过氧化反应的影响

王文斌，舒 慧，任 平

(1.武汉大学研究生院，湖北 武汉 430071;2.咸宁市中心医院;3.鄂州大学医学院;4.咸宁学院药学院)

目前，酒精的消费量呈全球性猛增趋势，ALD性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的发病亦显著增加，发病数仅次于占主要地位的病毒性肝炎［1］。ALD是因长期、大量饮用各种含乙醇的饮料所致的肝脏损害性病变，加之酒精中毒对神经系统、生殖系统的影响，使它已成为一种严重危害人们健康的疾病。另外，ALD又常和乙型/丙型肝炎合并存在，起到迭加的致病作用，更易并发肝硬化及肝癌。因此，对ALD的防治应予以高度重视，加强对ALD的宣传和防治研究成为当前面临的重要课题。目前治疗上还是以戒酒、营养支持为主，其他试用药物不甚理想，特别是西药，未有突破性进展，故在ALD的防治方面以中成药为主［2］。丹参(Sal via milt ior rhiz a Bunge)是一种常用中药，有活血化瘀、安神宁心、抗氧化等功效，其临床应用范围广泛［3］。目前有文献报道丹参对酒精所致的肝损伤同样具有改善作用，但机制不甚明了，本研究对其改善作用的可能机制进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂

丹参注射液(四川升和制药有限公司产品，15g生药/ml，每支 10ml)、丙二醛(MDA)试剂盒(批号20100313)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒(批号 20100516)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒(批号20100528)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)(批号20100421)均购自南京建成生物工程研究所，其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

722型光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);3-30K高速台式冷冻型离心机(德国sigma 公司 );分析天平(A＆D.Company.L imited.Tokyo.Japan)。

1.3 动物造模与分组

60只健康昆明雄性小鼠按体质量随机分成正常对照组、模型对照组、丹参注射液低剂量组(10g·kg-1·d-1)、丹参注射液高剂量组(20g·kg-1·d-1)，每组15只。正常对照组和模型对照组均给予生理盐水，各组动物每日腹腔注射1次，容积均为0.2ml·10g-1体质量，连续10d。末次给药后禁食12h，除正常对照组外，其余各组按12ml· kg－1体质量灌胃给予50%乙醇造成急性酒精肝损伤模型。

1.4 观察指标

灌胃给予酒精后禁食不禁水，8h后称体质量，并且摘眼球取血，3500r/min离心15min，取血清备测ALT、AST。迅速剖取肝脏称重，计算肝指数(肝指数=肝湿质量/体质量×100%)。4℃生理盐水冲洗，在肝脏左叶距边缘0.5cm处剪一小块肝组织置于10%甲醇溶液固定，备做病理切片，取相同部位肝脏0.5g加生理盐水制成10%匀浆液，备测肝组织 MDA、GSH-Px。

1.5 统计学处理

所有数据采用SPSS11.5软件进行统计分析，计量资料采用表达，两组间采用两独立样本的t检验;显著性检验以0.05和0.01为标准。

2 结果

2.1 一般情况、死亡率与肝指数

正常对照组小鼠基础状态良好。模型组小鼠基础状态变差，毛色干枯无光泽，活动减少，有些小鼠出现稀便现象，共死亡5只小鼠。低剂量组小鼠死亡4只，高剂量组死亡2只。丹参注射液低、高剂量组肝指数较模型组明显减低(P＜0.01或P＜0.05)。各组小鼠死亡率、肝指数比较结果见表1。

表1 各组小鼠死亡率、肝指数的变化

2.2 丹参注射液对急性酒精性肝损伤小鼠血清肝功能的影响

从表2可见，与正常对照组比较，模型组血清中ALT、AST活性显著增高，差异有显著性(均为P＜0.01)，说明造模成功。与模型组比较，丹参注射液低高剂量组可降低血清ALT、AST活性，两者差异有显著性(P＜0.01或 P＜0.05)。

表2 丹参注射液对急性酒精性肝损伤小鼠血清肝功能的影响()

表2 丹参注射液对急性酒精性肝损伤小鼠血清肝功能的影响()

与模型组比较，*P＜0.05、＊ ＊ P＜0.01;与正常组比较，△P＜0.01

组别 例数 ALT(U/L) AST(U/L)15 39.19 ±17.02 60.48 ±6.58模型组 10 95.96±28.41△ 156.41±12.93△丹参注射液低剂量组 11 69.01±17.77＊＊ 72.82±19.31*丹参注射液高剂量组 13 49.90±17.87＊＊ 60.00±6.56正常对照组＊＊

2.3 丹参注射液对酒精性肝损伤小鼠肝匀浆中MDA、GSH-Px的影响

表3可见，与正常对照组比较，模型组小鼠肝匀浆中MDA含量较高，差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，丹参注射液肝匀浆中MDA含量均较低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。与正常对照组比较，模型组小鼠肝匀浆GSH-Px活力较低，差异有统计学意义(P＜0.01)，与模型组比较，丹参注射液低高剂量组小鼠肝匀浆GSH-Px活力均较高，差异有统计学意义(P＜0.05)，丹参注射液低高剂量组可显著升高急性酒精性肝损伤小鼠肝匀浆GSH-Px水平(P＜0.01)，与对照组比较无差异(P ＞0.05)。

表3 丹参注射液对小鼠肝组织GSH-Px、MDA的影响()

表3 丹参注射液对小鼠肝组织GSH-Px、MDA的影响()

与模型组比较，*P＜0.05、＊＊ P＜0.01;与正常组比较，△P＜0.01

组别 例数GSH-Px(mgGSH/gprot)MDA(nmol/mgprot)15 291.67 ±19.65 2.12 ±0.23模型组 10 191.41±9.55△ 4.14±1.14△丹参注射液低剂量组 11 209.97±14.25＊＊ 3.03±0.634*丹参注射液高剂量组 13 258.18±14.86＊＊ 2.53±0.6正常对照组＊＊

2.4 各组小鼠肝组织病理变化比较

各组小鼠肝组织经石蜡切片，HE染色后在显微镜下观察，结果如图1所示。正常对照组肝小叶轮廓清晰，肝索排列整齐围绕中央静脉呈放射状，肝窦清晰可见，汇管区未见炎性细胞浸润;模型组肝细胞高度水肿，并可见气球样变，肝窦受压，可见血管充血和灶性坏死，部分区域伴炎性细胞浸润;丹参注射液低剂量组肝脏结构大致正常，肝细胞中度水肿，坏死不明显，可见炎性细胞浸润;丹参注射液高剂量组小叶结构基本正常，细胞轻度水肿，未见纤维化、脂肪变性及坏死。

图1 丹参注射液对小鼠脏组织病理学的影响(HE×400)

3 讨论

ALD是由长期大量饮酒所致的肝脏疾病。已知乙醇进入肝细胞以后，经过肝乙醇脱氢酶、过氧化氢体分解酶和肝微粒体乙醇氧化酶系3条途径氧化为乙醛。这个过程中可产生大量自由基，过量的自由基导致肝细胞及胞内膜结构中多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，形成脂质过氧化物如MDA等，导致更多脂类分解产物的形成，引起肝细胞损伤。MDA既能反映人体内氧化反应水平，也可作为损伤因子损伤人体，故MDA含量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤程度。脂质过氧化作用将活性氧转化为活性化学剂，通过链式或链式支链反应放大活性氧的作用［4，5］，同时由于活性氧积聚，使肝组织的抗氧化物质消耗增加，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平下降，并且乙醛本身能与GSH-Px的巯基以及抗氧化酶蛋白结合，使GSH-Px水平下降，而且肝功能异常、肝代谢紊乱、脂肪在肝细胞中沉积，进一步使得肝组织广泛脂肪样和空泡样变性，血清中甘油三脂也明显升高，最终肝细胞广泛坏死、肿胀死亡［6，7］。本实验模型组小鼠肝指数和血清ALT、AST活性明显升高，肝组织中MDA含量也有显著性增加，故可认为该急性酒精性肝损伤模型的制备是成功的。

丹参作为一种“活血化瘀药”在临床上主要用以治疗心血管系统疾病，在肝硬化、肝癌的辅助治疗也可见报道［8］。丹参具有良好的保护肝细胞免受损伤、促进肝细胞再生的作用［9］。丹参注射液主要有效成分是水溶性的丹参总酚酸，具有抗脂质过氧化的作用。本实验结果显示模型组小鼠肝内的GSH-Px活性显著低于正常对照组，MDA含量显著高于正常对照组，表明肝脏损伤时肝内抗氧化反应酶活性减低，脂质过氧化反应增强。我们采用不同剂量的丹参注射液给药，结果发现丹参注射液低、高剂量组的肝指数比模型组降低，血清ALT、AST也明显降低，肝脏病理学检查显示肝细胞坏死比模型组明显好转，同时丹参注射液低、高剂量组MDA含量明显降低，GSH-Px活性明显提高，提示丹参注射液对小鼠的酒精性肝损伤有一定的保护作用。其机制可能与减轻酒精对肝脏的脂质过氧化损伤反应，保护肝细胞的结构和功能，减少对肝组织细胞的损害作用，从而抑制酒精的肝毒性反应有关。

［1］凌奇荷，卿笃信.重视对酒精性肝病的研究［J］.中华消化杂志，2001，21(9):517

［2］方志明，陈小囡.丹参注射液对酒精性肝损伤大鼠血清IL-6水平的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2005，4:72

［3］杨卫东，朱鸿良，赵保路，等.丹参的氧自由基清除作用［J］.中国药理学通报，1990，6(2):118

［4］Kim SJ，Lee JW，Jung YS，et al.Ethanolinduced liver injury and changes in sulfur amino acid metabolo mics in glutat hione perox idase and catalase doubleknockout mice［J］.J H ePatol，2009，50(6):1184

［5］Beier JI，Luy endyk JP，Guo L，et al.Fibrin accumulation plays a critical role in the sensitization to lipopolysaccharide induced liver injury caused by ethanol in mice［J］.Hepatology，2009，49(5):1545

［6］邓源，班春林，武晓琼.乙醇诱导肝损伤作用机制的研究进展［J］.华北国防医药，2005，17(4):242

［7］杨明杰，周建嫦，黄俊明，等.酒精性肝病发生机制研究进展［J］.中国公共卫生，2003，19(3):367

［8］方文贤，宋崇顺，周立孝.医用中药药理学［M］.北京:人民卫生出版社，1998:899

［9］邓和军.丹参护肝机理研究［J］.中国中药杂志，1992，17(4):233