枯草芽孢杆菌木聚糖酶Xyn B在毕赤酵母中的表达

广西人口和计划生育研究中心 莫 毅

广西畜牧研究所 梁方方＊ 赖志强 卢玉发 廖玉英 何仁春 黄丽霞

华南农业大学动物科学学院 杨 琳

木聚糖酶能够降解饲料中的木聚糖，提高饲料利用率，降低畜禽肠道内饲料的黏度，从而提高饲料的有效能值和改善动物消化道的内环境，促进动物生长（张晓晖等，2007）。但由于从自然环境中筛选所获得的木聚糖酶产生菌存在产量低，木聚糖酶不易分离纯化、稳定性差、不同来源的酶适应性不同等不足，在一定程度上限制了木聚糖酶的动物饲料添加剂中的实际应用 （阮同琦等，2008；陈丛瑾等，2007）。

毕赤酵母 （Pichia pastoris）是一种高效的真核表达系统，该系统不仅克服了原核表达系统产物不易分离纯化和不能保持重组蛋白活性等缺点，且可对翻译后的蛋白进行适度糖基化修饰、折叠、加工，使生产的蛋白具有天然的高级结构及生物学活性（Anjali等，2009；Su 等，2007）。 此外，毕赤酵母具有遗传稳定性强，外源蛋白的表达基因操作简单、外源蛋白能正确加工与修饰、表达量高、易大量发酵培养、内源性蛋白分泌少和易纯化等优点，使得毕赤酵母成为目前应用较广的分泌型真核表达系统（Cereghino和 Cregg，2000）。本文通过将编码枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis strain GD3b）木聚糖酶（Xyn B）基因，克隆到 pPICZa A载体中，构建分泌型毕赤酵母表达载体pPICZa-Xyn B，重组质粒经线性化转入毕赤酵母X-33，经筛选获得可分泌表达Xyn B重组蛋白的毕赤酵母工程菌 X-33/Xyn B（莫毅等，2011）。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和菌株 大肠杆菌株E.coli.DH5a，毕赤酵母菌株X-33和重组质粒pUC-Xyn B由本实验室保存；质粒pPICZa A购于Invitrogen公司。

1.1.2 试剂 T4DNA连接酶、DNA分子质量标准、限制性内切酶Sac I、EcoR I和Xba I均购于TaKaRa大连宝生物技术有限公司；Ni-NTA磁珠购于法玛西亚公司；Zeocin、YPD、BMGY、BMMY培养基见Invitrogen公司的毕赤酵母操作手册（Invitrogen，2008）；其他常规试剂为进口分装或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pPICZa-Xyn B的构建 将pUC-Xyn B重组质粒中的Xyn B基因片段和pPICZa A载体使用EcoR I和Xba I双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生物有限公司）纯化后，按照Xyn B：pPICZa A数量比为3∶1取样混合，通过T4DNA连接酶4℃连接过夜；次日，取5 μL连接混合液转化感受态E.coli.DH5a，经复苏后，在 LB（Zeocin 25 μg/mL）平板上涂板，过夜培养。阳性转化子质粒进行EcoR I和Xba I双酶切鉴定。鉴定正确后，菌液委托上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.2.2 重组毕赤酵母的构建及筛选 以LiCl法将Sac I线性化的重组质粒pPICZa-Xyn B转化毕赤酵母宿主菌X-33，转化物涂布于YPD（Zeocin 100 μg/mL）平板，30 ℃培养 3 d。 将平板上的转化子分别于新的YPD（Zeocin 100 μg/mL）平板上划线接种，30℃培养3～5 d以获得较多的转化菌。

以pPCIZa A表达载体AOX引物AOX F：5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'，AOX R：5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'，挑取 7 株转化菌裂解为模版，进行PCR扩增（莫毅等，2011）。退火温度为58℃，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.3 Xyn B重组蛋白表达检测 经PCR鉴定后，挑取菌落水解圈最大的阳性转化子X-33/Xyn B转接于摇瓶进行扩培。取扩培后的菌株接种于10 mL BMGY培养基中，30℃，250 r/min振荡培养20 h。离心收集菌体，再将其悬浮于250 mL BMMY培养基中，继续30℃，250 r/min振荡培养，每隔24 h向BMMY培养基中补加甲醇至终浓度为1.0%进行诱导表达，约5 d取2.5 mL上清液与10 μL Ni-NTA磁珠混合，旋转振荡过夜；次日，离心收集Ni-NTA磁珠，并用PBS缓冲液洗涤3次，加入蛋白上样缓冲液制样进行SDSPAGE电泳检测。

2 结果分析

2.1 重组质粒pPICZa-Xyn B的构建 由图1可见，重组质粒pPICZa-Xyn B经双酶切鉴定得到2条特异性条带，分别与目的基因片段（642 bp）和线性pPICZa A载体（3600 bp）大小一致，表明Xyn B已定向插入表达载体pPICZa A中。重组质粒同时送上海生工生物工程有限公司测序，结果表明，插入的基因片段全长642 bp，读码框正确。

图1 重组质粒pPICZa-Xyn B双酶切鉴定

2.2 重组毕赤酵母X-33/Xyn B的筛选 7个重组毕赤酵母菌基因组使用AOX引物，经PCR鉴定结果见图2。由图2可见，7个重组菌均扩增出一特异性条带，与目的基因片段 （639 bp）+pPICZa A AOX测序区域（580 bp）大小一致，结果说明，所挑选的7个重组毕赤酵母菌基因组中已整合了Xyn B基因。

2.3 Xyn B重组蛋白表达检测 由图3可见，重组菌诱导表达得到明显的蛋白表达带，与重组Xyn B融合蛋白35.1 kDa大小相符（Xyn B基因的理论分子质量23.3 kDa+9.3 kDa的a信号肽+2.5 kDa的C末端标签），说明SDS-PAGE电泳已检测到了Xyn B的融合蛋白表达；此外，在45 kDa后还有一条较明显的条带，分子质量大于Xyn B融合蛋白的理论值，此结果与韩双艳等（2009）研究报道的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis B2）木聚糖酶Xyn重组菌诱导表达的重组蛋白分子质量大于理论分子质量的结果相似。可能与木聚糖酶蛋白序列存在6个N糖基化位点，2个O糖基化位点，重组蛋白表达过程中部分蛋白糖基化而引起的分子量偏大。而其他的杂带有可能是菌体本身的表达蛋白，分子量小，且量不多，可直接通过选择合适孔径的超滤管进行筛选，便于目的蛋白的纯化。

3 结论

分泌型酵母表达载体pPICZa A具有信号肽基因a-factor和甲醇诱导型强启动子AOX。afactor信号肽可帮助外源蛋白顺利的分泌到细胞外，方便了产物的检测和纯化；甲醇氧化酶启动子是强诱导型启动子，利于通过甲醇的诱导强化外源基因表达。 本研究选用pPICZa A作为表达载体，成功构建了重组质粒pPICZa-Xyn B，筛选到能够成功表达Xyn B重组融合蛋白的毕赤酵母X-33/Xyn B，为进一步研究重组木聚糖酶的酶学特性，开发优质的饲料添加剂奠定基础。

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