山银花皂苷提取条件优化研究

黄 佳 ，虢小翊 ，彭国平，黄 河，饶力群

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；3.湖南农业大学东方科技学院，湖南 长沙 410128）

山银花（Flos Lonicerae Confusae）为忍冬科忍冬属多年生木质藤本干燥花蕾或带初开的花。在山银花与金银花的鉴别上，原来均以绿原酸和木犀草苷为检测对象，该鉴别意义不大。2010年药典增加山银花中专属性较强的灰毡毛忍冬皂苷乙（Macranthoidin B）与川续断皂苷乙（Dipsacoside B）的总含量不得少于5.0%，它们皆为齐墩果烷型五环三萜皂苷。其中灰毡毛忍冬皂苷乙的分子式为C65H106O32，川续断皂苷乙的分子式为C53H86O22，该两种皂苷的提取工艺和药理试验研究均未见报道。有报道采用浸提法HPLC-ELSD联用一次性检测绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量，但其未考虑这两种皂苷的提取工艺。本试验采用热回流提取工艺进行研究，确定其最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

山银花供试品：湘蕾金银花（以下简称湘蕾），采自湖南隆回县小沙江镇；灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙对照品：纯度99%，购自成都曼斯特公司；乙醇、正丁醇：分析级，湖南化工研究院精细化工研究所；冰乙酸、乙腈：色谱级，上海德正化工有限公司。

1.2 试验仪器与设备

FW177中草药粉碎机（天津泰斯特），ALZ04电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），电热水浴锅WB-2000（上海浦东物理光学仪器厂），旋转蒸发仪RE-52AA（上海亚荣生化仪器厂），高效液相色谱仪Agilent 1100（安捷伦科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 提取方法 称取干湘蕾粉末5.0 g，放入圆底烧瓶中，乙醇回流提取，提取液过滤除渣后浓缩至干，用少量水溶解后正丁醇萃取，减压浓缩至浸膏状，水溶解并定容至150 mL。

1.3.2 单因素试验 （1）乙醇浓度对提取效果的影响：根据1.3.1方法，料液比1∶10，提取时间90 min，提取温度70℃，提取次数为1次，乙醇浓度分别设为50%、60%、70%、80%、90%。

（2）料液比对提取效果的影响：根据1.3.1方法，提取时间90 min，提取温度70℃，乙醇浓度70%，提取次数为 1 次，料液比分别设为 1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16。

（3）提取温度对提取效果的影响：根据1.3.1方法，料液比 1∶12，提取时间 90 min，乙醇浓度 70%，提取次数为 1次，提取温度分别为50、60、70、80、90℃。

（4）提取时间对提取效果的影响：根据1.3.1方法，料液比 1∶12，乙醇浓度 70%，提取温度 80℃，提取次数为1次，提取时间分别为75、90、105、120、135 min。

1.3.3 正交试验 根据单因素试验结果，进行L9（33）正交试验研究，确定最佳提取工艺参数。

1.3.4 分析方法 （1）HPLC检测条件：色谱柱为Boston Inc 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈和0.5%乙酸，梯度洗脱（表1）；检测波长208 nm；流速 0.5 mL/min，柱温 40℃。

表1 梯度洗脱程序

（2）标准曲线的制作：精密称取灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙对照品2.4 mg、1 mg，水定容至1 mL EP管中，分别配成浓度为2.4 mg/mL、1 mg/mL的储备液。然后用移液枪精密稀释成2.2、2.0、1.8、1.6、1.4 mg/mL 和 0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/mL。进样20 μL，记录相应的峰面积。以峰面积（mAU）为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线。

（3）供试品中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙含量的测定：采用HPLC检测条件，各稀释3倍后，进样20 μL。以峰面积定量，分别计算灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的浓度。

2 结果与讨论

2.1 灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的测定结果

2.1.1 对照品测定结果 灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的标准曲线分别为Y=5 087.6 X+2 865.4（R2=0.998 6）、Y=11 117 X+569.5（R2=0.994 5）。线性考察结果表明，灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙进样量分别在 1.4～2.4 mg/mL；0.1～1.0 mg/mL 范围内峰面积和进样量线性关系良好，出峰时间分别为25.1、27.4 min。

2.1.2 供试品测定结果 由图1可知供试品与对照品出峰时间几乎一致，峰型完整。可见可利用面积外标法计算灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量。

图1 山银花供试品溶液HPLC图谱

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇浓度 由表1可知，随着乙醇浓度的增大，灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙总提取率也随之升高。这说明这两种皂苷易溶于乙醇，且乙醇浓度越高，总提取率也越高。当浓度达到80%，趋于平缓。故取70%、80%、90%3个浓度水平进行正交试验。

表1 乙醇浓度对总提取率的影响

2.2.2 料液比 由表2可知，随着料液比的增加总提取率升高，当大于1∶14时提取率开始下降。故取1∶10，1∶12，1∶14 3 个料液比水平进行正交试验。

表2 料液比对总提取率的影响

2.2.3 提取温度 由表3可知，随着温度的升高，总提取率增加，这是由于温度的增加加快了这两种皂苷的溶解扩散速度，增大了溶解度。当温度达到70℃，提取率开始下降，这是由于灰毡毛忍冬皂苷乙的酯苷键受高温的影响不稳定，易分解产生次级苷。故取60、70、80℃ 3个温度水平进行正交试验。

表3 提取温度对总提取率的影响

2.2.4 提取时间 由表4可知，随着提取时间的增加，总提取率增加。当时间增加到90 min时总提取率趋于平稳。故取90、105、120 min 3个提取时间水平进行正交试验。

表4 提取时间对总提取率的影响

2.3 正交试验结果

在上述单因素试验的基础上进行三水平四因素的正交试验，因素和水平见表5，试验结果见表6。

表5 正交试验因素与水平表

表6 正交试验设计与结果

由表6看以看出，影响总提取率的因素顺序为：B>C>A>D，最优组合为A3B1C3D3，即乙醇浓度90%，料液比 1∶10，提取温度 80℃，提取时间 120 min。

2.4 验证试验

在正交试验得到的最佳工艺条件下进行验证试验，灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙总提取率可达到7.9%，见图2。

图2 山银花供试品溶液HPLC图谱

3 小结与讨论

试验采用HPLC法测定山银花中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的总含量，方法简便，结果可靠。采用有机溶剂乙醇回流提取的方法，通过对山银花的回流提取过程中影响有效成分的单因素进行考察，然后采用正交试验对提取工艺条件进行最优化。并在优化条件下进行验证试验，结果表明在乙醇浓度90%，料液比1:10，提取温度80℃，提取时间120 min的条件下，灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙总提取率达到7.9%。为评价山银花药材的内在质量提供了较全面的参考。

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