抗纤软肝胶囊微生物限度检查方法的验证

杨巨华 付 莺

湖北省中山医院药学部，湖北 武汉 430033

抗纤软肝胶囊是我院自制制剂，由多味中药组成，具有活血化瘀、软坚的功效。主要用于治疗肝纤维化，肝硬化等。处方中的海藻、丹参、当归尾有一定的抑菌作用［1－2］。如果直接按常规法做微生物限度检查，其中污染的微生物生长有可能被抑制，影响试验结果的可靠性。为此，笔者查阅了有关文献［3～4］，并按照《中国药典》［5］的要求进行多次实验，确定了抗纤软肝胶囊微生物限度检查方法，为抗纤软肝胶囊的微生物限度检查提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器设备 净化工作台、电热恒温培养(HHBIIS00.S型，)、真菌培养箱 (MJ－160B型)、均浆仪 (300～8000r/min)、电热恒温水浴锅 (H.S.G－IC－2)、煤电两用手提式压力蒸汽灭菌 (XXQ.SG41.280A)、电子天平 (AE200)。

1.2 实验菌种 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003、大肠埃希菌 CMCC(B)44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003，均由中国药品生物制品检定所提供。

1.3 培养基及稀释剂 营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，营养肉汤培养基，胆盐乳糖培养基(BL)，改良马丁培养基，改良马丁琼脂培养基，MUG培养基，曙红亚甲蓝琼脂培养基 (EMB)，均由中国药品生物制品检定所提供，按干燥培养基瓶签方法配制。PH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液，0.9%无菌氯化钠溶液，按《中国药典》2010年版一部附录方法配制。

1.4 样品 抗纤软肝胶囊:批号:101213、110325、110505;由湖北省中山医院制剂室生产。

2 细菌数、霉菌和酵母菌数测定方法的建立及验证

2.1 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，置35℃培养18～24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中25℃培养24～48h，然后分别用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1mL含菌数为50～100cfu/mL的菌悬液，备用;接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁斜面琼脂培养基中25℃培养5～7d，加入3～5mL含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，洗下霉菌孢子，吸取菌液至无菌试管中，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1mL含菌数为50～100cfu/mL的菌悬液，备用。

2.2 供试液的制备方法 取样品10g，加PH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液稀释至100mL，制备成溶解均匀的1:10的供试液。

2.3 回收率试验

试验组 取规定量的供试液和50～100cfu各试验菌株分别注入同一平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，平行制备2个平皿。细菌培养24～48h，白色念珠球菌和黑曲霉培养48～72h。

菌液组 取50～100cfu各试验菌株注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，白色念珠球菌和黑曲霉培养48～72h，平行制备2个平皿。测定所加入的菌数。

供试品对照组:取规定量供试液，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24－48 h，白色念珠球菌和黑曲霉培养48－72h。测定供试品本底菌数。

2.4 回收率的计算

2.4.1 常规法 取供试液1ml注皿，结果见表1。

表1 抗纤软肝胶囊常规法试验结果(cfu/皿)

表1表明，常规法对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率试验均高于70%，可采用常规法对抗纤软肝胶囊霉菌及酵母菌数计数。枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌的回收率均低于70%，表明采用常规法对抗纤软肝胶囊进行细菌计数不可行。

2.4.2 培养基稀释法 取供试液1ml注入2个平皿中(0.5ml/皿)，结果见表2。

表2 培养基稀释法 (cfu/皿)

表2表明，采用培养基稀释法 (0.5mL/皿)，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率达到70%以上，故可采用该法进行细菌计数。

2.5 细菌数、霉菌和酵母菌数测定方法验证。

验证结果见表3。

表3 3批抗纤软肝胶囊回收率试验结果 (%)

表3表明，采用培养基稀释法 (0.5mL/皿)，进行细菌微生物限度检验，3种试验菌回收率均大于70%。霉菌及酵母菌计数方法为常规法，其2种规定试验菌回收率均大于70%。方法可行。

3 控制菌检验方法的建立及验证

试验组 取1:10供试液10mL接种至100mL胆盐乳糖培养基，同时加入大肠埃希菌10～100CFU，35℃培养24～48h。取培养物0.2mL接种至含5mLMUG培养基的试管中，35℃培养24h，360nm紫外灯下观察荧光，然后进行靛基质试验，观察结果;另取培养物划线接种于曙红亚甲蓝(EMB)平板，35℃培养18～24h，观察其菌落形态。

阴性菌对照组 取金黄色葡萄球菌作为阴性对照试验菌，方法同试验组。

经胆盐乳糖培养基增菌培养后，试验组与阴性对照组相比较有明显的变化，试验组有明显产酸产气现象，结果见表4。

表4 大肠埃希菌检查常规法试验结果

表4表明，采用常规法进行大肠埃希菌检验，方法成立。

4 3批抗纤软肝胶囊的微生物限度检查

按上述所建立的抗纤软肝胶囊微生物限度检查法，对3批样品进行检验，细菌、霉菌及酵母菌数均小于10个/g，未检出大肠埃希菌。

5 讨论

5.1 《中国药典》要求，建立产品的微生物限度检查法，应进行细菌、霉菌、及酵母菌计数方法的验证。抗纤软肝胶囊是由多味中药组成的复方中药制剂，成分较为复杂，其中海藻、丹参、当归尾等具有抑菌作用，这些均可影响微生物限度检查的准确性，所以必须要建立抗纤软肝胶囊的微生物限度检查方法并加以验证。

5.2 经实验研究，采用常规法大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率试验均高于70%，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌采用培养基稀释法 (0.5 m1/皿)的回收率达到70%以上，控制菌采用常规法进行检验，可检出大肠埃希菌。故抗纤软肝胶囊微生物限度检查法可采用常规法检查霉菌、酵母菌和控制菌;培养基稀释法检查细菌。这为抗纤软肝胶囊的微生物限度检查法提供了科学依据。

［1］宋立人，丁绪亮等．现代中药学大辞典 (下) ［M］，第1版．北京:人民卫生出版社，2001:1791．

［2］宋立人，丁绪亮等．现代中药学大辞典 (上) ［M］，第1版．北京:人民卫生出版社，2001:443，823．

［3］田昭翠．郑氏骨伤药酒微生物限度检查法验证［J］．云南中医中药杂志，2011，32(2):64～65．

［4］孙乃霞．治伤消瘀丸微生物限度检查法的验证［J］．光明中医，2011，26(2):226～228．

［5］中国药典一部［S］．北京:中国医药科技出版社，2010:附录XIllC:79～88．