3，6－二羟黄酮抗乳腺癌发生过程中miRNA表达谱的变化＊

常 徽，王 湛，谢 艳，糜漫天

（第三军医大学营养与食品安全研究中心/重庆市营养与食品安全重点实验室，重庆400038）

微RNA（microRNA，miRNA）是小RNA的一种，可与其靶RNA的3′端非特异区结合，引起靶信使RNA（mRNA）的翻译抑制或降解。研究发现，某些miRNA在肿瘤的发生和发展过程中扮演非常重要的角色，起到癌基因或抑癌基因的作用［1－3］。miRNA的发现与研究为乳腺癌的防治提供了新的途径［4－6］。植物黄酮抗肿瘤作用研究一直受到关注，但其抗肿瘤机制是否涉及对miRNA表达和功能的影响，国内外尚少见报道。本研究前期药效学筛选试验发现3，6－二羟黄酮具有很强的抗肿瘤作用［7－9］，但其体内抗肿瘤发生效应尚缺乏研究。本研究观察3，6－二羟黄酮对 N－甲基－N－亚硝脲（MNU）诱导大鼠乳腺癌发生的抑制作用，同时利用基因芯片技术检测大鼠乳腺组织miRNA表达谱的变化，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 6～7周龄健康雌性SD大鼠，体质量145～165g，由第三军医大学实验动物中心提供［scxk（军）2007015］，饲养于SPF动物实验室。雌性SD大鼠依照完全随机设计原则均分为自然对照、模型对照和实验组，自然对照组8只，模型对照和实验组各14只。MNU和3，6－二羟黄酮购自Sigma公司，Trizol为Invitrogen公司产品，GeneChip®miRNA芯片及相关试剂盒均为美国Affymetrix公司产品，本芯片覆盖了71个物种的miRNA，针对7 815个 miRNA设计了共计46 228个探针，数据来自 Sanger miRBase miRNA database V11（http：//microrna.sanger.uk）。

1.2方法

1.2.1动物处理 实验组给予3，6－二羟黄酮灌胃（20mg·kg－1·d－1），两对照组给予生理盐水灌胃，实验组和模型对照组一次注射MNU 50mg/kg，制造乳腺癌动物模型，自然对照组注射生理盐水，分组喂养18周，观察各组肿瘤发生率。另取雌性SD大鼠，以前述方法分组和处理，每组12只，分别于MNU注射0、4、8、18周取材，提取乳腺组织总RNA并分离miRNA，通过芯片扫描和数据分析获得miRNA表达谱。

1.2.2乳腺组织总RNA的提取 剪取大鼠乳腺组织0.1g，制备组织匀浆，利用Trizol试剂抽提数次，常规提取总RNA。每个样品取1μL，ddH2O稀释200倍后用核酸蛋白定量仪测定RNA含量与纯度。整个过程所有使用的器械及液体均经0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水处理，戴消毒手套操作，防止RNA酶污染。

1.2.3miRNA表达谱的检测 取50～100μg总RNA，利用miRNA Isolation Kit分离小 RNA，采用PolyA Polymerase加尾，利用T4RNA连接酶将带有生物素标记的信号分子与之连接，进行标记，然后将生物素标记的小分子RNA溶于16μL杂交液中［15%甲酰胺，0.2%聚丙烯酰胺（SDS），3×柠檬酸钠缓冲液（SSC），50×纯化试剂（Denhardts）］。于42℃与微阵列杂交过夜。杂交结束后，微阵列玻片于42℃下用含0.2%SDS的2×SSC漂洗4min，再在0.2×SSC室温漂洗4min。玻片甩干后，用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪进行扫描，采用微阵列显著点分析（SAM）2.1版软件分析有统计学意义的差异表达位点。

1.3统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，肿瘤发生率的比较采用χ2检验，两组间差异比较采用t检验，所有数据均以s表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.13，6－二羟黄酮膳食干预对乳腺癌发生的抑制作用 实验结束时，3组大鼠之间体质量差异无统计学意义，表明3，6－二羟黄酮膳食处理对大鼠无明显毒副作用。自然对照组大鼠无乳腺肿瘤发生。与模型对照组相比，实验组乳腺肿瘤发生率降低了35.8%，显著低于模型对照组，表明3，6－二羟黄酮膳食处理能够显著抑制化学致癌剂MNU诱导的大鼠乳腺肿瘤发生，见表1。

表1 3组膳食干预对MNU诱导大鼠乳腺肿瘤发生率及体质量的影响

2.2大鼠乳腺肿瘤发生过程中miRNA表达谱的变化及3，6－二羟黄酮膳食干预的影响 miRNA芯片检测结果表明，致癌剂MNU注射后，大鼠乳腺组织miRNA表达谱发生显著变化，其中MNU注射4周时，模型对照组检测到11个miRNA表达显著上调，18个miRNA表达显著下降；8周时12个miRNA表达显著上调，17个显著下降；18周时17个显著上调，18个显著下降，见表2。与模型对照组相比，实验组4周时检测到10个miRNA表达显著上调，9个miRNA表达显著下降；8周时15个miRNA表达显著上调，10个显著下降；18周时11个显著上调，12个显著下降，见表3。这些miRNA可能在3，6－二羟黄酮抗乳腺癌发生过程中发挥作用。

表2 MNU诱导大鼠乳腺肿瘤发生过程中miRNA表达谱的变化

表3 与模型对照组相比实验组大鼠miRNA表达谱的变化

3 讨 论

植物黄酮为一类天然植物多酚化合物，具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤等生物学效应，特别是其抗肿瘤活性以其天然、低毒、高效而备受关注［10－11］。本研究前期药效学筛选实验发现，3，6－二羟黄酮具有很强的体外抗肿瘤活性，对乳腺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、白血病细胞均表现出强细胞毒性和凋亡诱导作用［7－9］。3，6－二羟黄酮的抗肿瘤作用国内外尚少见报道，特别是其体内抗肿瘤效应如何尚不清楚。MNU诱导大鼠乳腺癌发生是研究乳腺癌发生的经典动物模型，本课题利用此动物模型观察了3，6－二羟黄酮抗乳腺癌发生的效应，结果表明，3，6－二羟黄酮膳食干预可显著抑制致癌剂诱导的大鼠乳腺肿瘤发生，显示出较强的乳腺癌化学预防作用。

miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它可以抑制蛋白质翻译，剪切mRNA，调节靶基因的表达，在动植物中参与转录后基因表达调控。越来越多的研究表明，miRNA参与包括肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌及白血病在内的多种肿瘤的发生、发展［12－13］。乳腺癌是女性最常患的一种肿瘤，男性由于缺乏对乳腺癌的免疫能力，同样容易罹患此病。有研究发现作为抑癌基因和原癌基因的乳腺癌特异性miRNA，在乳腺癌发生、发展中的作用对于防治乳腺癌具有重要意义［14－15］。

植物黄酮抗乳腺癌作用机制中是否涉及对miRNA表达和功能的影响，尚少见报道，本实验研究发现，3，6－二羟黄酮抗乳腺癌发生过程中，伴随着miRNA表达谱的改变，提示某些miRNA可能在3，6－二羟黄酮抗乳腺癌作用机制中扮演重要角色，黄酮化合物可能通过调节miRNA的表达进而影响某些关键靶蛋白的活性。本研究结果对深入探讨miRNA在植物黄酮抗肿瘤机制中的作用提供了参考。

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