应用生物反应器生产高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原

梅建国，王玉茂，王文秀，唐世云，丁 壮，沈志强＊

（1.吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春 130062；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

高致病性猪繁殖与呼吸综合征（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP－PRRS），俗称高致病性猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）变异株引起的猪的高度接触性传染病，目前仍没有十分有效的药物和治疗方法。采用高质量的疫苗进行积极有效的预防接种，仍是控制该病最为重要的手段之一[1]。疫苗质量的优劣直接决定着免疫接种的成败，抗原制备作为疫苗制造的重要环节，无疑是决定疫苗质量的关键因素。目前，国内绝大多数动物疫苗的生产仍采用传统的转瓶生产工艺。这种工艺生产出来的疫苗表现出产品批间差异大、质量稳定性差、不良反应大、抗原滴度低、免疫效果差等缺陷，大大降低了我国动物疫苗产品的质量，已明显不能满足动物防疫的客观需要[2]。

本研究采用细胞生物反应器技术生产PRRSV抗原，并对培养过程中的各项技术条件进行优化，从而总结出一套较为合理的生产工艺，为HP－PRRSV的大规模培养提供可靠的参考数据。同时，将反应器工艺得出的试验结果与传统的转瓶工艺结果进行比较，显示了新型工艺的优越性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和毒种 Marc－145细胞系、HP－PRRSV致弱株，为山东省滨州畜牧兽医研究院生物技术重点实验室保存。

1.1.2 主要试剂与仪器 DMEM细胞培养基干粉为Invitrogen公司产品，优级新生牛血清为兰州民海生物工程有限公司产品，细胞培养级葡萄糖为Sigma公司产品，AP20SC型激流式细胞生物反应器、一次性工艺袋（包括激流袋、灌注袋等）及纸片载体为杭州安普生物工程有限公司的设备和耗材，SBA－40E生物传感分析仪为山东省科学院生物研究所产品，CO2培养箱为Thermo Electron公司产品，细胞培养转瓶（3L）为天津市恒明石英玻璃制品有限公司产品，细胞培养转瓶机为黄石恒丰医疗器械有限公司产品。

1.1.3 培养基 细胞培养生长液：DMEM培养液加入60mL／L的新生牛血清；细胞培养维持液：DMEM培养液加入20mL／L的新生牛血清。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏与扩增 将细胞冻存管从液氮罐中取出，于37℃水浴中迅速融化。常温1000 r／min离心3min，弃上清，用少量细胞培养生长液悬浮后无菌移入T25细胞培养瓶中，加入10mL新鲜细胞培养生长液，置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中静置培养。待细胞长成完好单层后，用胰酶－EDTA消化液消化，分散悬浮，并按细胞悬液体积比为1∶3的比率逐级从T25、T75至T175细胞培养瓶中进行扩增传代。当细胞达到一定数量后，按2个T175细胞传入1个3L转瓶中培养，转瓶中细胞的传代比率亦为1∶3，培养液体积为500mL。

1.2.2 Marc－145细胞的反应器培养

1.2.2.1 反应器细胞接种 选取长成完好单层的转瓶细胞15瓶，胰酶－EDTA消化液消化后，用细胞培养生长液混悬，对细胞悬液计数后，按3×109cells确定接种所需要细胞悬液体积，并将细胞接种入灌注袋（杭州安普公司一次性细胞培养袋，内装有无菌片状细胞培养载体）内，充分混匀[3]。安装好灌注袋和反应器系统后，补充细胞生长液至10L，并以450mL／min的流速先使细胞悬液从灌注袋中自下而上循环15min，再以从上而下的流向循环15 min。然后对培养液取样，镜检，视野中细胞少于10个说明细胞于载体上贴壁正常（此标准由杭州安普公司提供）。此时，将液体流向设定为自灌注袋中由下而上循环，流速调整为400mL／min。

1.2.2.2 反应器参数控制 反应器培养过程中的控制参数见表1。

表1 反应器培养过程中的控制参数Table1 The control parameters of the bioreactor during the culturing process

1.2.2.3 反应器中细胞糖耗量检测 反应器内细胞生长过程中每8h对培养液进行取样，用SBA－40E生物传感分析仪测定培养液中葡萄糖含量，计算每8h细胞糖耗量，判定细胞生长状况。

1.2.2.4 补碱与流加糖 配制浓度为200g／L的葡萄糖溶液2L，无菌过滤后将补料管安装在补料泵上，当培养液中糖浓度低于2g／L时进行人工手动流加葡萄糖，每次流加葡萄糖20g[4]。将浓度为75g／L的NaHCO3溶液，高压灭菌后将碱瓶管安装到碱泵上，设定碱泵控制为自动，使其根据培养液pH变化自动补碱。

1.2.2.5 Marc－145细胞的反应器培养 按1.2.2.1～1.2.2.4的方法，完成20110920P、20111116P、20111213P三个批次的Marc－145细胞的反应器培养。此三批细胞只进行细胞培养，不做病毒增殖。主要目的是研究反应器培养过程中细胞的糖代谢规律，确定细胞数量峰值的时间，从而准确把握细胞的最适接毒时间。

1.2.3 HP－PRRSV的转瓶培养和反应器培养

1.2.3.1 HP－PRRSV的转瓶培养 选取细胞汇合度达80%的转瓶细胞3瓶，用滴度为每0.1mL含105.75TCID50的 HP－PRRSV悬液，每瓶接种10mL，每24h分别取样，等体积充分混匀后测病毒效价[5]。按此方法，连续进行20110523P、20110606P、20110628P三个批次的HP－PRRSV转瓶培养，测定该法制备的HP－PRRSV滴度。

1.2.3.2 HP－PRRSV的反应器培养 按照1.2.2.1描述的方法，完成Marc－145细胞在激流式细胞反应器中的培养过程。按照1.2.2.3的方法，每8h测定细胞糖耗量，在糖耗量达到最大值时即认为细胞数量已出现峰值[4]，此时更换为细胞培养维持液，接种滴度为每0.1mL含105.75TCID50单位的 HP－PRRSV悬液200mL，约 MOI＝0.04（TCID50／cell）的量进行接种感染。对病毒增殖过程的120h进行细胞耗糖量检测，每8h取样测糖耗，每24h取样测定培养液中的病毒滴度[5]。分析病毒增殖规律，观察病毒峰值出现的时间，确定最佳病毒收获时间。依此方法，连续完成20120418P、20120625P、20120726P三个批次生物反应器的病毒培养，并对工艺进行研究分析，确定最佳病毒收获时间和最优化的工艺条件。

1.2.3.3 病毒效价测定方法 采用Reed－Muench法计算TCID50来测定病毒效价[6]。

2 结果

2.1 Marc－145细胞的反应器培养

连续进行 20110920P、20111116P、20111213P三个批次的Marc－145细胞的反应器培养，研究反应器培养过程中细胞的糖代谢规律，确定细胞数量峰值的时间，从而准确把握细胞的最适接毒时间。细胞每8h糖耗量和每24h糖耗量分别如图1、图2所示。

从图2中72h和96h的细胞日糖耗量测定结果可以看出，20110920P、20111116P、20111213P三个批次细胞在反应器中培养至72h后，均开始进入稳定期。因此，选择在72h至96h之间进行接毒是可行的。然而，从图1来看，细胞每8h糖耗的各个峰值中，以88h峰值最高。80h至88h糖耗略有上升，也说明了活细胞数仍有小幅度增加，至88 h达到最大。因此，88h左右应该是病毒接种的最佳时间。由于此三批细胞经过72h～96h测定，结果表明糖耗量进入稳定期，推定细胞数量已不再增长，因此糖耗测定至此为止，没再进行后续测定。

图2 Marc－145细胞在反应器培养过程中日糖耗量与培养时间的关系Fig.2 The relationship between daily glucose consumption of Marc－145cells and cultivation time in bioreactor

2.2 HP－PRRSV反应器培养

通过对20120418P、20120625P、20120726P三个批次HP－PRRSV反应器培养工艺进行研究分析，确定最佳病毒收获时间和最优化的工艺条件。在反应器培养工艺中，三个批次的HP－PRRSV反应器培养前期细胞每8h糖耗量和每24h糖耗量结果（图3、图4）。

图3 细胞生长每8h糖耗量与培养时间的关系Fig.3 The relationship between 8hglucose consumption of Marc－145cells and cultivation time in the cell growth stage in bioreactor

图4 细胞日糖耗量与培养时间的关系Fig.4 The relationship between daily glucose consumption of Marc－145cells and cultivation time in the cell growth stage

从图4和图2来看，细胞在进入72h后，6个批次（其中20110920P、20111116P、20111213P三个批次只做细胞培养，未做病毒增殖）的Marc－145细胞日糖耗量均达到相当的水平。对比图3和图1可以看出，细胞在每个代谢周期中均会出现一个峰值，分别为16、48、72、88h，而在这些峰值中以88h最大。因此，细胞上反应器后培养至88h，糖耗量均达到最大值。这样，我们认为此时反应器内活细胞数也达到最大量。于是，我们在88h进行病毒接种，每批细胞接毒量为200mL滴度为每0.1mL含105.75TCID50单位的 HP－PRRSV悬液。细胞接种病毒后，糖耗水平会有一定幅度的上升，因为病毒的合成与增殖需要消耗葡萄糖。而且糖耗水平与病毒增殖水平存在一定的正相关性[7]，这可以从图5、图6、图7的对比分析中能够看出。图3、图4反应的是细胞在反应器内生长阶段的糖耗水平，由于反应器内细胞培养至88h已接种病毒，因此细胞生长阶段糖耗量测定至此结束。88h后进入病毒增殖阶段糖耗量测定（图5、图6）。

从图5可以看出，细胞每8h糖耗量在88h达到最大值，说明88h前后是病毒增殖最为活跃的时期。而图6表明，细胞日糖耗在96h达到峰值，随后出现明显下降趋势。因此可以推断，病毒接种96 h后，反应器内的Marc－145细胞因病毒感染而出现大量病变和死亡。

2.3 HP－PRRSV的转瓶培养和反应器培养的滴度比较

按照常规转瓶生产工艺，连续进行20110523P、20110606P、20110628P三个批次的 HP－PRRSV培养，测定该法制备的HP－PRRSV滴度随培养时间的变化关系。应用反应器细胞培养技术，完成20120418P、20120625P、20120726P三个批次的HP－PRRSV生产。测定各个批次HP－PRRSV滴度随培养时间的变化关系，结果如表2和图7所示。

图5 病毒增殖阶段每8h糖耗量与培养时间的关系Fig.5 The relationship between 8hglucose consumptionof Marc－145cells and cultivation time in the virus proliferation stage

图6 病毒增殖阶段日糖耗量与培养时间的关系Fig.6 The relationship between daily glucose consumption of Marc－145cells and cultivation time in the virus proliferation stage

表2 两种生产工艺的HP－PRRSV滴度对比Table2 Comparison of HP－PRRSV titers between two different production processes

图7 两种工艺各批次培养液中HP－PRRSV滴度与时间的关系Fig.7 The relationship between the HP－PRRSV titer and cultivation time in two different processes

图7表明，反应器培养中，接种病毒后，病毒滴度在96h达到高峰，随后快速下降，这与图6中的细胞每24h糖耗量随时间变化有相似之处。而每8h糖耗表明，在接毒后88h细胞糖耗量达到最大值，这说明此时细胞代谢最为活跃，病毒增殖最快，由于此时病毒并未释放到培养液中，因此还不能检测到。96h后，24h糖耗量达到最高，随着细胞的病变和死亡，大量病毒释放到培养液中，使得此时培养液中病毒滴度最高。因此，反应器培养时，细胞接毒后96h左右是病毒收获的最佳时间。另外，从表2可以看出，转瓶工艺培养的HP－PRRSV滴度平均要比反应器工艺培养的 HP－PRRSV 滴度低0.6TCID50／0.1mL。如果用病毒浓度计算，则有4倍差距，这也显示了反应器培养工艺的优越性。

3 讨论

应用激流式生物反应器培养Marc－145细胞，生产高致病性猪蓝耳病病毒抗原，既能实现细胞的高密度培养，又能在一定程度上提高HP－PRRSV滴度，增加了抗原产量，提高了工作效率。另外，与传统的转瓶工艺相比，反应器工艺节省了大量人力和生产用地，大大降低了生产成本。反应器工艺自动化水平较高，生产过程稳定可控，降低了产品批间差异，从而大大提高了病毒抗原的产品质量。然而，激流式生物反应器培养工艺在本研究中也存在一些难以解决的问题。在细胞培养和病毒增殖过程中，不能对细胞进行取样观察，只能依靠测定细胞糖耗量来判定细胞状态，这样测定结果的误差将会直接导致决策的失误。而反应器中细胞的数量也只能依靠反应器厂家给出的经验值和实时糖耗水平来确定。由于细胞从纸片载体上剥离相当困难，所以该法在规模上很难实现逐级放大。而且，细胞种子的制备仍然采用转瓶培养方法，因此对于100L以上规模的反应器来说，细胞种子制备较为困难。这些问题也是目前利用片状载体进行细胞培养的填充床式反应器在实际应用中面临的共同难题[8]。

研究发现，细胞在反应器中每8h糖耗量关系图与每24h糖耗量关系图有较大区别，我们认为这跟细胞生长周期有关。因为在一个细胞生长周期内，每个生长阶段糖耗量是不一样的，而对每个生长周期来说，细胞的糖耗量则基本一致。由于8h只代表细胞生长周期内的一个阶段，而24h则包括了整个生长周期。因此为了更为准确地判定细胞生长状态，我们增加了每8h这个时间段来测定细胞糖耗量。另外值得一提的是，我们将灌注袋中的病毒悬液经反复冻融三次后取样测病毒滴度，结果发现比激流袋中的病毒悬液高出近1TCID50。分析原因，我们认为高出部分的病毒应是由载体上的细胞内释放出来。由于灌注袋中里层的纸片载体细胞与外周培养液中的物质交换较慢，因此细胞代谢水平、细胞的病毒感染和病毒增殖速度都较外层载体上的细胞低[8]。于是，当外层载体细胞释放病毒后，我们就收获了病毒悬液。此时，里层载体上细胞内的病毒并没有得到有效释放，经反复冻融细胞破裂后，才释放到病毒悬液中。这也与反应器内细胞在接种病毒120h，日糖耗量虽有所降低但仍维持在10g以上的事实情况相符。因此，在实际生产过程中，在接种病毒96h出现滴度高峰收获病毒悬液后，如果再向反应器中注入新鲜维持液继续培养，将有可能大大提高病毒抗原产量。

[1]Ni J Q，Yang S B，Bounlom D，et al.Emergence and pathogenicity of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Vientiane，Lao People′s Democratic Republic[J].J Vet Diagn，2012，24（2）：349－354.

[2]徐家华，陈瑞爱，唐秀英，等.动物细胞规模化培养及其在兽用疫苗生产中的应用[J].动物医学进展，2009，30（5）：105－108.

[3]梅建国，沈志强，庄金秋.30L生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂[J].中国生物制品学杂志，2010，23（4）：428－430.

[4]Chu C，Lugovtsev V，Golding H，et al.Conversion of MDCK cell line to suspension culture by transfecting with human siat7egene and its application for influenza virus production[J].PNAS，2009，106（35）：14802－14807.

[5]陈文庆，王建超，刘华杰，等.悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的比较分析[J].中国兽药杂志，2010，44（10）：37－41.

[6]殷 震，刘景华.动物病毒学[M].北京：科学出版社，1997：329－331.

[7]Bertolotti－Ciarlet A.The 3′End of Norwalk Virus mRNA Contains Determinants That Regulate the Expression and Stability of the Viral Capsid Protein VP1：a Novel Function for the VP2Protein[J].J Virol，2003，77（11）：11603－11615.

[8]梅建国，庄金秋，王金良，等.动物细胞大规模培养技术[J].中国生物工程杂志，2012，32（7）：127－132.