N-乙酰-L-半胱氨酸对急性胰腺炎大鼠脑保护作用的实验研究

史敬东，赵 晶，程 石，孙忆林，宋茂民

（首都医科大学附属北京天坛医院，北京 100050）

胰性脑病（PE）是一种继发于急性胰腺炎（AP）的神经系统并发症，其认知功能改变，死亡率高，但是发病机制尚未完全清楚。N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）是一种新型的抗氧化剂，有研究表明NAC是谷胱甘肽的前体，可抑制氧化张力诱导的细胞凋亡，提高神经细胞的存活率。本研究通过建立AP大鼠模型，观察通过注射NAC缓解AP时脑损害的发生和发展。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级SD大鼠90只，雄性，购自北京维通利华实验动物有限公司。随机分成3组：正常对照组30只，AP组30只，AP +NAC注射组30只。

1.2 AP动物造模型以及给药方法

造大鼠AP模型[1]，大鼠术前12 h禁食，不禁水。1%戊巴比妥钠（25 mg／kg）腹腔注射麻醉，正中切口入腹，于肝十二指肠韧带肝门侧用小动脉夹暂时夹闭胰胆管，由十二指肠前壁进针，进入胰胆管内，夹闭胆胰管出口，以0.1mL/min匀速逆行注入5%牛磺胆酸钠（0.1 mL/100 g）(购自Sigma公司)，10 min后去除动脉夹，关腹。AP+NAC组造完模型后立刻给予动物由阴茎背静脉注射NAC（购自Sigma公司），剂量为200 mg/kg体质量。24 h后取标本。

1.3 脑组织含水量测定

采用常用的干重、湿重法测定：取出鼠脑的部分枕叶迅速用电子天平直接称湿重，然后放在80℃烤箱中36 h烤干，测鼠脑的干重。脑组织含水量=（湿重一干重）÷湿重×100%。3组各随机取10只。

1.4 脑组织TNF-α、MDA含量测定

取部分额叶脑组织按重量：冰生理盐水体积的比（w／v）=1∶4常规制备20%的匀浆，用ELISA法测定脑组织匀浆中TNF-α的含量（试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司），按试剂盒操作说明的方法进行；采用化学比色法检测脑组织匀浆中MDA含量（试剂盒购自南京建成生物工程研究所）。3组各随机取10只。

1.5 脑组织病理学观察与微血管内白细胞计数

常规HE染色，按孔雷等[2]的方法，光镜下观察、计算20个脑微血管断面聚集附壁的白细胞总数，再求得每组的均数。3组各随机取10只。

1.6 透视电镜片制作

取大鼠海马CA1区经前固定、后固定、脱水、包埋后切片观察。

1.7 统计学分析

2 实验结果

结果见表1。

2.1 脑组织水含量

脑组织水含量在AP组[（80.39±1.31）%]明显比正常对照组[（76.51±1.07）]高。但在AP+NAC注射组脑组织水含量明显比AP组的低[（78.09±1.53）%]

2.2 脑组织TNF-α含量

AP组脑组织TNF-α含量1927.23±326.70 pg/mL明显比正常对照组221.92±53.91 pg/mL高。但是AP+NAC组与AP组相比，明显降 低，为（840.14±251.26）pg/mL。

2.3 脑组织丙二醛（MDA）含量

AP组脑组织MDA含量1.26±0.06 nmol/mL明显比正常对照组0.71±0.02 nmol/mL高。但是AP+NAC组与AP组相比，明显降低，为（0.93±0.05）nmol/mL。

2.4 微血管内白细胞聚集附壁数目

与正常对照组（5.3±0.7）相比，AP组（72.5±3.8）白细胞数明显升高，但AP+NAC组（42.4±5.7）白细胞数与AP组相比明显减少。

表1 脑组织含水量、TNF-α、MDA含量、白细胞计数结果

2.5 脑组织形态学检查

取大鼠脑组织切片，透视电镜下可见组1大鼠脑细胞显微结构正常，无病变。（图1）

组2大鼠神经元细胞出现明显的边集现象及线粒体、内质网均出现不同程度的变性（图2）。

组3大鼠脑细胞线粒体有轻度肿胀，细胞核、内质网无异常（图3）。

图1

图2

图3

3 讨论

NAC作为一种抗氧化剂，能使细胞内还原型的谷胱甘肽以及过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶的含量升高，抑制TNF-α的释放，具有保护细胞的作用。许多研究表明，炎症反应在脑缺血神经元损伤中有重要作用，Carroll等研究大鼠中动脉闭塞模型缺血再灌注时，发现用NAC治疗可缩小大脑梗塞区体积。但建新等[3]研究也表明，NAC可以抑制TNF-α的表达，保护脑细胞。在海马等富含多不饱和酸的神经组织中，容易受到自由基的攻击而损伤。刘辉国等[4]发现NAC可以通过降低海马组织MDA的含量，以此降低了氧化应激反应。主动脉壁细胞间黏附分子-1（ICAM-1）在体内有较为广泛的分布，但主要表达在血管内皮细胞。ICAM-1是一类介导细胞之间、细胞与细胞外基质之间黏附的糖蛋白，刘永刚等[4]在研究中发现，在脑缺血中用NAC干预后ICAM-1表达减少。另外秦文等[5]研究表明NAC可以增加星形胶质细胞能量供应，改善细胞能量代谢障碍，减轻细胞的损伤。

PE时白细胞激活，耗氧量增加，并且产生大量的自由基，MDA是脂质过氧化物中的主要代谢产物，对细胞有损伤作用。此外，很多研究证实TNF-α含量明显升高[6]，TNF-α是天然免疫和特异性免疫的重要细胞因子，含量过高时可导致炎性损害，在重症胰腺炎中参与介导脑组织的损伤。

本研究基于这些背景，旨在探讨NAC干预急性胰腺炎时脑损伤的发生和发展过程中的脑保护作用。我们在制作AP模型的当天给予注射NAC，目的是发挥NAC的早期干预作用，连续注射是发挥NAC干预PE的发展过程，我们发现，在NAC的干预下，脑组织含水量、脑组织TNF-α和MDA含量以及白细胞聚集附壁数量与AP未做任何处理组均降低。所有结果表明NAC对大鼠AP时的脑损伤有明显的脑保护作用。

[1]许永春,李兆申,屠振兴,等.改良逆行胰胆管注射法制备轻重不同两种大鼠急性胰腺炎模型[J].第二军医大学学报,2004,25(11):1 251-1 252.

[2]孔 雷,韩天权,于颖彦,等.大鼠侧脑室注射细胞因子对脑损伤的形态学研究[J].外科理论与实践,2006,10(1):51-52.

[3]但建新,秦 龙,陈 炼,等.N-乙酰半胱氨酸预防大鼠脑缺血再灌注损伤的实验研究[J].2006,35(5):521-524.

[4]刘辉国,张志锋,高永平,等.N-乙酰半胱氨酸对慢性间歇缺氧大鼠海马神经元凋亡及氧化应激的影响[J].中国病理生理杂志,2008,20(1):39-40.

[5]秦 文,张晓侠,刘 萍,等.N-乙酰半胱氨酸对糖氧剥夺大鼠皮层星形胶质细胞的保护作用[J].山东大学学报(医学版),2008,46(9):859-862.

[6]赵海平,吕飞飞,欧阳晓晖.丙二醛/超氧化物歧化酶及肿瘤坏死因子-α在大鼠实验性胰性脑病中的作用[J].中国普外基础与临床杂志,2008,15(5):337-341.