不同剂量电子线照射宫颈癌细胞后红外光谱研究*

陈长青，魏英耐，潘志峰，刁振琦，张建民，饶凤飞，唐伟跃，齐 键

(郑州大学物理工程学院，河南 郑州 450001)

1 引言

宫颈癌指发生在宫颈的鳞状上皮细胞及宫颈管内膜的柱状上皮细胞交界处的恶性肿瘤。在全球妇女恶性肿瘤中宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二种最常见的恶性肿瘤。在发展中国家妇女中其发病率居第一位。据国际癌症研究中心(IARC)近年估计五年患病为1558000，其中100余万在发展中国家，30余万在发达国家。我国是一个宫颈癌患病率和死亡率均占世界三分之一的大国，每年新发病例有13.5 万人［1］。

放疗是近年来治疗恶性肿瘤最常用的手段之一，放疗就是用放射线对肿瘤患者采取的一种治疗手段。70%以上的肿瘤患者都需要采用放疗才能得到缓解或治愈。因此研究新的检测、分析阶段性肿瘤治疗应用前景甚广。

傅立叶变换红外光谱可以反映分子水平的结构和化学变化，因而在生物、化工等相关研究领域内被广泛应用。近年来随着振动光谱实验技术的进步，用傅立叶变换红外光谱方法研究肿瘤已屡有报道。构成组织和细胞的基本物质是核酸、蛋白质、糖和磷脂等，因此细胞和组织的红外光谱应是这些成分及其相互作用的表征。在组织癌变的过程中，这些组分含量、构型、构象、分子间及分子内相互作用等方面的改变均会发生变化。

本研究就是利用细胞培养技术和傅立叶变换红外光谱技术，研究不同剂量的电子射线辐照对人宫颈癌细胞内部各成分的影响。采用不同剂量的电子射线辐照宫颈癌细胞后，必然会对细胞内部的生物大分子造成一定的辐射损伤，从而改变其构象和含量。通过采集辐照不同剂量放射线的细胞的傅立叶变换红外光谱，可以发现不同辐照条件下细胞内部的差异性与规律性，进而从分子水平揭示细胞中的某些生物大分子的含量、构象发生的变化。采集红外光谱，方便、快捷、准确、经济，从物理学能级结构的角度来研究癌细胞受放射线损伤后的变化，可以为临床肿瘤治疗提供一定的实验参考依据。

2 实验材料及仪器

细胞:人宫颈癌细胞株(购于上海细胞库)。

仪器:37℃、5%CO2的细胞培养箱、小型台式离心机TGL－16G(由河南省生物工程重点开放实验室提供);美国Varian 2300C/D直线加速器(由郑州大学肿瘤医院提供);德国CHRIST冰冻干燥机，型号ALPHA1－2LD(由郑州大学基础学院提供);美国NicoletIR200傅立叶变换红外光谱仪(由郑州大学化学系提供)。

3 实验方法

样品制备:

分别取相同数量的处于指数生长期的宫颈癌细胞，分成 5 个剂量组(2Gy，6Gy，9Gy，11Gy，15Gy)和一个空白对照组(0Gy，对照组除不受电子线照射外，所处环境条件和其他各组完全一样)，各组下设三个平行组。按设定剂量对各剂量组进行电子线照射，然后置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养24h。

胰蛋白酶消化、离心机离心、三蒸水清洗之后收集细胞至离心管，放入冰冻干燥机中冰冻干燥24小时后研磨成粉末，取1mg左右的样品粉末与200mg左右的KBr粉末混匀后压制成薄膜状KBr压片，卤化物片基KBr在整个中红外区是透明的，所以对样品的红外光谱几乎没有影响，将KBr压片样品置于傅立叶变换红外光谱仪的光路上进行红外光谱的采集。

仪器参数设置:

直线加速器参数设定:电子线能量为12MeV，源皮距100cm，照射野面积10×10cm2。

红外光谱仪参数设定:光谱范围4000cm－1－400cm－1，分辨率1cm－1，扫描次数16 次。

4 光谱分析讨论

电子线照射宫颈癌细胞继续培养24h后，分别采集4000cm－1－400cm－1范围内空白对照组和各剂量组的FTIR光谱，如图1所示(图中所标注数字分别表示设定的剂量 0，2，6，9，11，15Gy)各组细胞不管是从峰形还是强度上呈现不同变化，但基本趋势相同，11Gy剂量组在2000cm－1－2500cm－1波段特殊变化是受水分子影响，但其余生物大分子的特征峰与以往实验相比未有差别，因此不予考虑。纵观红外谱图的差异性说明电子线照射宫颈癌细胞影响细胞内部物质新陈代谢，改变物质相对含量，对抑制宫颈癌细胞无限繁殖起到一定积极的作用。

结合图1红外光谱峰位对蛋白质分子N－H基团振动谱带，酰胺Ⅰ谱带、酰胺II谱带，磷酸二酯基团(PO2－)的伸缩振动谱带分析如下。

图1 电子线照射宫颈癌细胞继续培养

4.1 蛋白质分子N－H基团振动谱带

图2 N－H基团振动谱带

如图2所示，宫颈癌细胞蛋白质分子中的N－H基团的伸缩振动谱带位于3413cm－1处。经不同剂量电子线照射后，波数变化显示，除9、11Gy剂量组波数变小外，其他剂量组波数普遍变大，其中9Gy剂量组波数减小最明显。根据N－H基团伸缩振动谱带向低波数频移，N－H基团的氢键化程度变大［2］，电子线与蛋白质分子碰撞时，损失能量提供给N－H基团促使其氢键化，造成9，11Gy剂量组谱带频率向低波数频移。

吸收强度变化显示，各剂量组吸收强度减小，9Gy剂量组减小量大于其余各剂量组。这表明，在所设定剂量组中，9Gy剂量组宫颈癌细胞N－H基团氢键化程度变大造成N－H基团含量大幅度减少，综合以上两方面表明，与其他剂量组相比，9Gy电子线可以影响宫颈癌细胞蛋白质分子中的N－H基团结构及含量，破坏宫颈癌细胞原有蛋白质分子结构，促使细胞趋于正常。

4.2 蛋白质分子的酰胺Ⅰ谱带、酰胺II谱带

蛋白质二级结构特征与氢键的形成方式紧密相关，这种氢键结构的差异能够在对于氢键敏感的红外光谱中得到反映。将酰胺I带和II带结合起来定量分析蛋白质二级结构的相对含量可以扬长避短，更加准确地分析蛋白质二级结构。如图3所示，空白对照组中1654cm－1、1542cm－1处的吸收峰分别归属于蛋白质分子的酰胺Ⅰ带、酰胺II带。经不同剂量电子线照射后，谱带频移显示，酰胺Ⅰ带基本没有频移。据文献报道［3］，癌组织中酰胺II带波数高于正常组织对应谱带波数，考虑到蛋白质二级结构无论α－螺旋、β－折叠、β－转角或其他构象，都有其特定的氢键结构，推断蛋白质分子间的氢键遭到破坏，构象变得疏松无序，使吸收峰向低波数移动，从而表现出酰胺II谱带移。

取不同剂量1654cm－1、1542cm－1处的相对强度比I1654/I1542，如图4所示，在所设定的各剂量组中，I1654/I1542在9Gy组中最小。肿瘤组织中酰胺Ⅰ带、II带的相对峰强比I1654/I1542明显高于正常组织，I1654/I1542可以作为判断组织癌化程度的一个有效指标［4］。说明宫颈癌细胞在9Gy时的癌化程度最小，由此判断该剂量电子线照射能够更大程度地抑制宫颈癌细胞的新陈代谢，促使恶变细胞内部蛋白质相对含量减少，细胞良性转化效果较明显。综合频移和相对吸光度，9Gy剂量以破坏蛋白质分子氢键为途径，改变蛋白质分子中二级结构相对含量。

4.3 磷酸二酯基团(PO2－)的伸缩振动谱带

DNA是公认的射线作用靶，无论是射线直接还是间接作用都能造成细胞中DNA结构的损伤［3］。红外光谱中磷酸二酯基团对称伸缩振动谱带和反对称伸缩振动谱带是研究核酸分子构象的主要谱带。空白对照组宫颈癌细胞磷酸二酯基团对称伸缩振动νs(PO2－)谱带对应于1084cm－1，反对称伸缩振动νas(PO2－) 谱带对应于1236cm－1。

图5 PO2－振动谱带图

谱带频移如图5所示，1084cm－1谱带普遍向高波数频移，9，11，15Gy高波数频移幅度小;1236cm－1谱带普遍向高波数频移4－6cm－1。有文献报道，癌组织中，当振动频率为1220cm－1左右时，磷酸二酯基团基本上被氢键所结合，反对称伸缩振动频率为1240cm－1～1260cm－1时，磷酸二酯基团完全没有被氢键结合［4］。反对称伸缩振动频率表明，与对照组相比，经不同剂量电子线照射后，癌细胞内的磷酸二酯基团完全没有被氢键结合，这表明大剂量照射更易阻止磷酸二酯基团结合氢键，可能是抑制其组织癌细胞继续恶化的有效途径。

如图6所示，图中:1反映各剂量组与空白对照组磷酸二酯基团反对称伸缩振动谱带相对吸收强度，2反映各剂量组与空白对照组磷酸二酯基团对称伸缩振动谱带相对吸收强度。1，2图形相似，表现为均在9Gy组出现相对强度最小值;鉴于相对吸收强度侧面反映物质含量变化，说明9Gy剂量组磷酸二酯基团含量减少，而单核苷酸借磷酸二酯基团相互连接形成的多核苷酸键是核酸的基本结构。磷酸二酯基团含量减少必然引起核酸含量减少，有报道称肿瘤细胞中DNA和RNA含量增多，核酸分子中强度增加，从侧面反映，细胞癌变过程中，核酸含量增加，细胞无限增殖的特性［5］。综合频移和相对强度变化推断9Gy剂量组最大程度地减少核酸含量及其构象，抑制宫颈癌细胞无限增殖，从根本上改变了宫颈癌细胞进一步恶化的趋势。

图6 各剂量组PO2－(νs和νas)与对应空白组

5 结语

综合生物统计分析和光谱分析方法，分析不同剂量电子线照射宫颈癌细胞的傅立叶变换红外光谱数据，得到以下结论:

1)不同剂量电子线照射宫颈癌细胞，3413cm－1在9Gy剂量组波数减小最明显，电子线与蛋白质分子碰撞时，损失能量提供给N－H基团促使其氢键化，造成9Gy剂量组谱带频率向低波数频移;1542cm－1带普遍红移，蛋白质分子间的氢键遭到破坏，构象变得疏松无序，使吸收峰向低波数移动，表现出酰胺II谱带红移;1084cm－1谱带普遍向高波数频移，1236cm－1谱带普遍向高波数频移4 －6cm－1，阻止磷酸二酯基团结合氢键可能是其抑制癌细胞继续恶化的有效途径。

2)不同剂量 1654cm－1、1542cm－1处的相对强度比I1654/I1542在9Gy组中最小，说明宫颈癌细胞在9Gy组以破坏蛋白质分子氢键为途径，改变蛋白质分子中二级结构相对含量，更大程度地抑制宫颈癌细胞的新陈代谢，该组的癌化程度最小。

综合以上，初步推断电子线照射普遍影响宫颈癌细胞的蛋白质、核酸、脂类分子构象。本实验所设定剂量中，无论从谱带频移还是谱带强度变化角度分析，9Gy电子线照射影响宫颈癌细胞的效果都最明显，9Gy电子线可作为临床上电子线治疗宫颈癌的有效参考剂量。

［1］宋学红，王秋曦，宋玉芳.影视阴道镜在子宫颈病变诊断中的应用［J］.中华妇产科杂志，2001，36(5):278－281.

［2］高体玉，慈云祥，李峻.应用傅立叶变换红外光谱研究白血病骨髓血红细胞［J］.北京大学学报(自然科学版)，2001，37(2):224.

［3］陆逸仙，张岳灿，等.脑部恶性肿瘤组织切片的红外光谱研究［J］.中国临床神经科学，2000，8(4):278－279.

［4］石景森，王健生，等.胆囊癌组织的红外光谱研究［J］.中华医学杂志，2005，85(32):2287－2288.

［5］刘金绪，韩伟，等.关于宫颈癌变细胞红外光谱测定方法的研究［J］.分析测试学报，1998，17(6):50－52.