亚硫酸法降解沙棘籽原花色素的条件优化1)

田亚新 王运来 韩晓云 刘继伟 康传红

(黑龙江大学，哈尔滨，150080)

我国具有丰富的沙棘资源，在沙棘的根、茎、叶、果实中均有天然原花色素，其中以沙棘籽中原花色素的含量最高。原花色素是一类黄烷－3－醇类单体及其C4－C8或C4－C6键连接而成聚合体的多羟基酚类化合物，分子骨架为C6C3C6［1］，是植物生长过程中的次生代谢产物，因在酸性介质中加热能产生花色素(anthocyanidin)而得名［2］，因其聚合体表现出单宁特性，因此也称缩合单宁。原花色素具有良好的清除自由基、抗氧化和抗癌等生物活性，已广泛的应用于食品、化妆品和医药等领域。沙棘原花色素的生物活性跟其聚合度密切相关，多聚原花色素因其分子量较大和位阻效应影响了酚羟基的活性［3］，导致其生物活性降低，而天然植物中的原花色素多以多聚体形式存在，因此，原花色素的降解研究受到广泛关注。目前，研究较多的原花色素的降解方法有催化氢解［4］、微生物降解、亚硫酸降解等方法［5］，相对比较亚硫酸降解方法具备操作简单、价格低廉等特点，更适合于规模生产。因此，文中采用亚硫酸作为降解试剂，寻求最佳降解条件。

1 材料与方法

沙棘籽，沙棘采自黑龙江省阿城县，使用组织捣碎机破坏果肉，筛取沙棘籽干燥，再经组织捣碎机粉碎，过60目筛后备用。

沙棘籽原花色素粗提品制备:取干燥的沙棘籽粉20 g，加入一定量的石油醚，在回流装置中20℃脱脂5 h，自然挥发除去残余石油醚，得到脱脂沙棘籽粉。称取20 g脱脂沙棘籽粉进行原花色素粗提，提取条件为60%酒精、料液比为1∶8(g∶L)、pH值为3、提取温度为20℃，提取60 min(重复3次，合并提取液)，过滤，离心，旋转蒸发浓缩提取液，得到原花色素粗提品。

沙棘籽原花色素亚硫酸降解单因素优化:60%乙醇溶解沙棘籽原花色素作为待降解溶液。取待降解液，加入一定量亚硫酸，按照设定温度进行水浴降解。取降解后溶液1 mL，分别用甲醇和乙酸定容至2 mL，测定其500 nm吸光度值，计算出其平均聚合度。分别改变降解温度、降解时间、料液比和亚硫酸用量，考察各因素对原花色素降解效果的影响。

式中:DP为平均聚合度;m为原花色素质量(μg);n为原花色素物质的量(μmol);M为单体(+)－儿茶素的相对分子质量。原花青素的质量按照传统的香草醛—盐酸法测得，物质的量则用香草醛—乙酸的方法测定［7］。

沙棘籽原花色素亚硫酸降解条件优化:根据单因素试验结果，取反应温度、反应时间、料液比、亚硫酸用量为优化因素，按照均匀设计表U11(1110)结构设计试验方案。按照单因素的试验流程进行降解试验，测定原花色素的质量和摩尔量，计算平均聚合度，以平均聚合度为试验结果进行多元回归分析，得到最佳试验方案和预测值。最后按照均匀设计法优化得到的试验条件进行验证试验。

2 结果与分析

2.1 亚硫酸降解原花色素的单因素条件优化

2.1.1 反应温度对降解效果的影响

为考查温度对亚硫酸降解效果的影响，分别在温度为50、60、70、80、90 ℃ 条件下进行水浴降解反应。试验结果表明:在反应时间、料液比、亚硫酸用量一定时，随着反应温度的增加，平均聚合度逐渐降低，降解程度也逐渐增加。其中50～60℃变化最为剧烈，60℃以后变化趋缓，在温度达到80℃时平均聚合度降至最低，原花色素降解效果最佳。

2.1.2 反应时间对降解效果的影响

原花青素的降解需要时间，为了考察反应时间对降解效果的影响，分别在降解时间为30、60、90、120、150 min条件下，检测降解效果。试验结果表明:随着时间的延长平均聚合度降低，最初降解速率最快，30～60 min平均聚合度下降了10%左右，此后降解变慢，120 min时平均聚合度达到最低。

2.1.3 料液比对降解效果的影响

为考查料液比对亚硫酸降解效果的影响，配置料液比分别为1 ∶8、1 ∶9、1 ∶10、1 ∶11、1 ∶12(g ∶L)，进行水浴降解反应。试验结果表明:在其他条件不变时，随着料液比的增加，平均聚合度有降低趋势，但当料液比超过1∶9后，变化不明显。

2.1.4 亚硫酸用量对降解效果的影响

亚硫酸作为降解剂，其用量对降解效果应该有一定的影响，在保证反应体系总体积一定的情况下，分别加入 0、1、2、3、4 mL 的亚硫酸，考察亚硫酸用量对降解效果的影响。试验结果表明:在反应时间、反应温度、料液比一定时，随着亚硫酸用量的增加，平均聚合度逐渐降低，当亚硫酸用量为1 mL时，平均聚合度为最低值。

2.2 均匀设计法优化原花色素降解条件

通过原花色素单因素优化结果表明，反应温度、反应时间、料液比和亚硫酸用量对降解都具有一定的影响。为了综合考察各种影响因素，采用均匀设计法进一步进行降解条件优化。按照均匀设计表U11(1110)结构设计试验方案，以平均聚合度为考察指标，进行设计优化。优化方案及结果见表1。

表1 沙棘籽原花色素亚硫酸降解均匀设计优化方案及试验结果

按照表1数据，利用Excel中的Linest函数分别建立针对表1中各因素一次一元回归方程、二次一元回归方程、一次二元回归方程，判断复相关系数(R2，越接近1越好)，以及比较F统计值与置信度分别为0.05、0.01的临界F值(通过 Finv函数计算)的大小(F统计值应大于临界F值)，优选以上回归方程，并再次利用Linest函数形成新的回归方程为:y=0.000172x+18.730814x－0.000038x1x2x3+0.002352x1x3+0.000971x1x2－0.111792x1－0.040954x2+0.096 241x3－7.109 051x4+5.771 492，其中x1代表反应温度(℃);x2代表反应时间(min);x3代表料液比;x4代表亚硫酸用量。

经计算，F统计值为22.35，置信度为0.01时的临界F值为11.39，置信度为0.05时的临界F值为5.19，F统计值大于临界F值;R2=0.95，比较接近于1。由F统计值和R2值可以得出结论，得到的回归方程显著性较好。

利用Qbasic程序，预测到最佳降解时间为60 min、降解温度为80℃、料液比为1∶8、亚硫酸体积分数为12%时，得到最低平均聚合度。按照以上方案进行验证试验，降解前平均聚合度为13.42，降解后平均聚合度为7.53，降解效果明显。

3 结束语

考虑到试验研究所考察的水平数较多，文中在单因素试验的基础上，采用均匀设计法设计试验方案。均匀设计方法是一个空间填充设计方法，寻求试验数值点内的均匀分散，其在合理的试验组数内能够暴露出各个因素以及因素之间对结果的影响情况，具有节约性、稳定性和灵活性等特点，目前，已在多个领域内广泛应用。试验结果表明，均匀设计法设计的试验方案合理，结果可靠。

亚硫酸降解方法具备降解效率高、操作简单、价格低廉等特点，非常适合于工业化生产。但是，考虑到沙棘籽原花色素主要用于食品和药品，降解后亚硫酸的去除是一个非常值得重视的问题，需要科学工作者进一步地研究和探讨。

［1］Prieur C，Rigaud J，Cheynier V，et al.Oligomeric and polymeric procyanidins from grape seeds［J］.Phytochemistry，1994，36(3):781－784.

［2］Gabetta B，Fuzzati N，Griffini A，et al.Characterization of proanthocyanidins from grape seeds［J］.Fitoterapia，2000，71(2):162－175.

［3］Jorge M.Ricardo D S，Darmon N，et al.Oxygen free radical scavenger capacity in aqueous models of different procyanidins from grape seeds［J］.J Agric Food Chem，1991，39(9):1549－1552.

［4］杜晓，唐伟，廖学品，等.落叶松多聚原花色素的Pd/C催化氢解反应研究［J］.化学研究与应用，2005，17(4):456－459.

［5］刘文洁，戴晶晶，周兴燕，等.葡萄籽原花青素化学降解工艺研究［J］.食品工业科技，2009，30(7):229－231.

［6］田亚新.沙棘籽原花色素提取分离及性质研究［D］.哈尔滨:黑龙江大学，2008.

［7］姚开，何强，吕远平，等.葡萄籽提取物中原花青素含量的测定［J］.食品与发酵工业，2002，28(3):17－19.