DM120方对糖尿病大鼠肾组织转化生长因子β1表达的影响*

杨雪蓉 姚 政 陶 枫 徐佩英 顾逸梦 徐隽斐 沈远东 陆 灏△

（1.上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203；2.上海中医药大学，上海 201203）

糖尿病肾病（DN）是糖尿病常见的并发症之一，其发病率约占糖尿患者的35%～40%，患者一旦出现微量蛋白尿，其肾功能将不可逆转地进行性下降，直至出现终末期肾功能衰竭。本实验通过观察中药复方DM120方对高脂饲料联合链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠肾组织转化生长因子β1（TGF-β1）蛋白表达的影响及形态结构的改变，探讨其对糖尿病肾脏病变的保护作用和机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性Wistar大鼠40只，体质量80～120 g，清洁级，由中国科学院上海实验动物中心提供。饲养于上海中医药大学动物实验中心。自由饮水，不限制活动，每日光照时间12 h，环境温度控制在18～28℃之间。

1.2 药物与试剂 DM120方（黄芪、葛根、生地黄、丹参），药物购自上海中医药大学附属曙光医院，上药用蒸馏水浸没约120min，然后再加数倍蒸馏水，持续煮沸约30 min。取过滤液，再次加适量蒸馏水煮沸，持续约30 min，合并两次滤液并浓缩至2000 mL。分次将滤液离心，2500 r/min，30 min，合并上清液，再次煮沸30 min，将煎剂浓度调整至每毫升浓缩液含生药3 g，4℃冰箱保存。STZ美国Sigma公司生产。高脂饲料由中国科学院上海实验动物中心提供，配方为100 kg中含73 kg基础饲料，20 kg猪油，4 kg白糖，2 kg全脂奶粉，1 kg胆固醇；脂肪约占总能量比的36%。24 h尿微量白蛋白（U-Alb），试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体，由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.3 仪器 罗氏Advantage快速血糖仪；ASP300自动脱水机、G1160石蜡包埋机、RM2235切片机、HI1220烤片机，德国LEICA公司；台式冷冻离心机：ABI-7300（美国应用生物系统有限公司，Z-216MK（HERMLE）；全自动生化分析仪：Unical Dx600 Synchron clinical system。

1.4 模型建立 适应性喂养1周后，喂养高脂饲料和基础饲料的混合料，2周后改为完全高脂饲料。喂养6周后，随机取30只由腹腔注射STZ 30 mg/kg，另10只腹腔注射缓冲液，继续喂养高脂饲料，4周后断尾采血测血糖，在造模的30只中选血糖异常者（血糖>16.7 mmol/L）继续喂养高脂饲料2周，复核血糖后随机取20只进入实验。

1.5 分组及给药 将模型大鼠分别置于代谢笼内留取24 h尿液，测定24 h U-Alb，然后按24 h U-Alb排泄量分为模型组、DM120方组。未造模者作为正常组。整个实验期间，所有大鼠均给予基础饲料。DM120方组给予DM120煎剂按0.5 mL/100 g体质量 （相当于生药15 g/kg体质量）灌胃；模型组给予等量0.9%氯化钠注射液灌胃；正常组：基础饲料喂养，不做其他处理。每日1次，连续8周。每周记录大鼠生长情况1次。

1.6 标本采集与处理 于第8周末，再次分别置代谢笼内留取24 h尿液，计量后离心，去除沉渣，-20℃保存，采用ELISA法测定24hU-Alb。末次给药后禁食12h，用3%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉，取主动脉采血5 mL，采血样本分离血清，检测血糖（BG）、肌 酐 （SCr）、尿 素 氮 （BUN）、胆 固 醇 （TC）、三 酰 甘 油（TG）。取肾皮质，组织块厚约2 mm，10%中性甲醛固定24 h，脱水后浸蜡，石蜡包埋，制成4 μm厚度的切片。免疫组化检测：取石蜡切片，脱蜡、水化，用3%H2O2室温15 min灭活内源性过氧化物酶，微波修复联合复合蛋白酶修复暴露抗原，加封闭蛋白，室温5 min滴加一抗和生物素化二抗，DAB显色，苏木精覆盖切片，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析，每张切片在400倍镜下取不重叠的两个视野，测量阳性染色区域的总面积和累积光密度值。

1.7 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件。正态分布的数据用（±s）表示，各组均数比较采用方差分析，组间两两比较用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠 SCr、BUN、24 h U－Alb比较 见表1。 治疗 8周后，正常组大鼠无死亡，模型组大鼠死亡1只，DM120方组大鼠死亡2只。模型组大鼠SCr、BUN、24 h U-Alb水平均较正常组明显升高（P＜0.01）；而 DM120方治疗组大鼠 SCr、BUN水平均较模型组下降（P＜0.05），24 h U-Alb水平较模型组明显下降（P＜0.01），差异均有统计学意义。

表1 各组大鼠 SCr、BUN、24 h U-Alb 比较（±s）

表1 各组大鼠 SCr、BUN、24 h U-Alb 比较（±s）

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组 别 BUN（mmol/L） 24 h U-Alb（μg/24 h）正常组 5.90±1.96 7.54±1.52 9 45.25±7.96**DM120 方组 8 37.38±7.42△ 7.38±1.72△ 8.99±0.93△△n SCr（mmol/L）10 33.13±6.33模型组 9.65±2.52** 16.53±1.22**

2.2 各组大鼠BG、血脂水平比较 见表2。模型组大鼠BG水平较正常组明显升高（P＜0.01），TG有一定程度的升高，TC变化不显著；而DM120方组大鼠BG较模型组下降（P＜0.05），TG较模型组明显下降（P＜0.01）。

表2 各组大鼠 BG、TC、TG 水平比较（mmol/L，±s）

表2 各组大鼠 BG、TC、TG 水平比较（mmol/L，±s）

9 21.54±2.27**DM120 方组 8 18.40±4.14△ 2.46±0.75 0.84±0.21△△BG 10 6.25±0.49模型组 2.67±0.59 1.29±0.42组 别 TC TG正常组 2.69±0.58 1.18±0.19 n

2.3 各组大鼠肾组织病理学观察 见图1。模型组肾小球肥大，系膜区增宽，基质增生明显，肾小球基底膜增厚，毛细血管腔瘤样扩张，可见肾小管萎缩和扩张，肾小管上皮细胞空泡变型，管型形成，小管间质有少量炎性细胞浸润。DM120方组有类似改变，但病变程度较轻。

2.4 各组大鼠肾组织TGF-β1表达 见图2、表3。显示，TGF-β1阳性反应为肾小球或肾小管胞质出现褐色或棕黄色颗粒沉淀。模型组显色浓重，TGF-β1表达最强，DM120方组显色范围较模型组局限，显色较轻浅，TGF-β1表达较轻。经对大鼠肾组织免疫组化积分光密度测定表明，与正常组比较，模型组显著高于正常组（P＜0.01）；DM120 方组较模型组显著下降（P＜0.01）。

表3 各组大鼠肾组织TGF-β1积分光密度比较（±s）

表3 各组大鼠肾组织TGF-β1积分光密度比较（±s）

组 别 n 积分光密度正常组 20 3729.05±2530.49模型组 20 17639.52±5982.20**DM120 方组 20 8392.86±3982.03△△

3 讨 论

DN的特征性病理改变是肾基底膜增厚和系膜区为主的细胞外基质（ECM）积聚，导致弥漫性或结节性肾小球硬化。随着研究的不断深入，TGF-β1已被公认为是最强的致纤维化因子，其可调节ECM代谢，抑制多种肾脏细胞的生长、凋亡和分化。肾小球和肾小管上皮细胞均可以分泌TGF-β1，在糖尿病早期患者的肾小球中即有TGF-β1表达增多，其后贯穿整个发病过程并随病程呈渐进性升高［1］。TGF-β1可破坏足细胞，损伤滤过膜，导致肾小球屏障功能受损［2］。TGF-β1表达升高，肾小球系膜扩张和基底膜增厚，刺激Ⅳ型胶原等ECM组分合成增加，导致肾小球功能障碍，加重肾脏病变；同时通过调节肾脏基质降解酶体系，影响肾小球ECM的局部沉积，促进肾脏纤维化［3-5］。既往研究表明，TGF-β1是高糖状态下肾脏巨噬细胞激活后的炎性产物，是糖尿病重要的细胞因子。高糖状态下，肾小球固有细胞PKC信号通路被激活，使MAPK活性增加，激活肾内TGF-β/Smad信号通路，促进纤维连接蛋白启动基因活性的过度表达，从而使周围血管通透性增加，基质沉积，导致肾脏纤维化［6-7］。本实验中，DM120方可明显下调TGF-β1蛋白表达，这可能是其改善尿微量白蛋白排泄量、治疗DN的机制之一。

DN 属于中医学“消渴”、“尿浊”、“虚劳”、“水肿”、“关格”等范畴。历代医家认为，本病多由于消渴日久、迁延不愈而并发。现今许多医家认为本病的基本病机是气阴两虚，其他均为气阴两虚之变证。病之初期以阴伤为主，迁延日久，阴伤及气，临床多表现为气阴两虚之证，且以肾脏气阴两虚最为突出，瘀血为主要兼夹之邪，常贯穿于病理始终。此所谓肾水不足，肝木失养，肝肾阴虚，阴虚阳亢，肾元封藏无权，阴虚耗气，气阴两伤，肾气不固，精微外泄。阴虚火旺煎熬津液，气虚运血无力，瘀血阻于肾络。病势缠绵，久病必瘀，久病入络，故有瘀血阻滞之标实。故治疗当以益气养阴、活血化瘀为要，DM120方正是宗此治疗大法而创立的组方，经过临床反复实践，疗效确切。本实验结果提示，DM120方能够改善肾小球肥大，减轻肾脏病理损害，保护肾功能，推测其机制可能与降低TGF-β1表达有关，从而改善肾脏组织的纤维化，对DN有一定的保护作用。

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