男性年龄对精子氧化应激水平、核DNA损伤的影响

乜照燕 吴海峰 张 娜 郭丽娜 赵素英 甄秀丽 张 轶

1.河北医科大学第四医院生殖医学科(石家庄，050011);2.河北省胸科医院检验科

我国育龄夫妇不孕不育的发病率约为15%，在不孕不育患者中，男性因素占40%，精子质量对人类生存繁衍至关重要。随着生育年龄的推迟，女方年龄对生育存在的不利影响已成共识，男性生育力是否随着年龄增加而降低的研究甚少，且存在争议。精液分析作为男性生育力测定的基本方法，男性精液常规参数与年龄关系已有研究，在众多与男性不育有关的因素中，随着自由基理论的建立和发展，人们发现活性氧(ROS)介导的氧化应激对精子的损伤作用，可能是男性不育的原因之一。精子DNA完整性对自然受孕、人工授精、胚胎、胎儿、婴儿甚至成人的发育至关重要，但对精子ROS和精子DNA损伤是否受年龄影响知之甚少。本研究旨在通过对精子ROS和精子DNA损伤与男性年龄的相关性研究，探讨男性年龄与ROS和精子DNA损伤的关系。

1 资料和方法

1.1 研究对象

在本科室因女方因素进行体外受精－胚胎移植的男性精液标本95例，按男方年龄分为3组，年龄＜35岁组40例、35～39岁组34例，≥40岁组21例，年龄34.61±8.45岁，无外伤及遗传性疾病史，无性功能障碍史，体检未发现有明显睾丸、附睾及输精管异常。身体健康，无吸烟、酗酒和长期接触有害物质史，无生殖道感染和精索静脉曲张史等。过氧化物酶染色法排除白细胞精子症。

1.2 方法

1.2.1 精液标本采集 禁欲3～7 d，采用手淫法取精液，获取全部精液于干净容器，立即送精液检查室，在室温下精液完全液化后，行精液常规检查。每份精液标本留取1ml，其中0.5ml精液用于检测ROS和精子DNA损伤。

1.2.2 精液分析 精液液化后按照文献［1］的要求行精液常规手工分析。所有分析由同一名工作人员完成。精子形态学分析采用WHO《人类精液及精子－宫颈粘液相互作用实验室检验手册》第四版推荐的Diff－Quick快速染色方法进行染色，油镜下采用Kruger的精子形态学标准，每张涂片至少取10个油镜视野(×1 000)对精子形态进行评估，计数200个精子，计算出每份精液样本的正常精子形态百分率。

1.2.3 精子膜脂类过氧化反应 精子膜脂类过氧化反应的程度以反应产物丙二醛 (MDA)的产量表示，MDA测定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。0.2ml精液，2ml PBS离心去除精浆后(1 200 r/min，离心5min)按说明书操作，用酶标仪(Rayto RT－6100)读取光密度值。

1.2.4 精子DNA损伤测定 采用精子吖啶橙(AO)染色法［2］，取0.2ml液化精液，用 pH 7.4 0.01mol/L PBS洗涤精子3次，弃去上清液，调整精子浓度至20×106/ml凃片，晾干，用甲醇固定。用新鲜配制的A0染液染色 5min，水洗，晾干，荧光显微镜(OLYMPUX－BX51)观察(激发滤光片波长460～490nm)，每个视野观察时间不超过40s。正常精子双链DNA呈绿色，受损伤的精子呈红色或黄色。每张涂片至少取10个油镜视野(×1 000)，计数200条精子中绿色(G)、红色(R)和黄色(Y)精子数，计算出DNA损伤精子的百分率。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 3组精液参数、精浆ROS水平和精子DNA损伤的比较

≥40岁组的a+b级精子百分率低于＜35岁组(P＜0.05)，精浆ROS水平高于＜35岁组和35～39岁组(均P＜0.05)，精子DNA损伤率高于＜35岁组(P ＜0.05)，见表1。

表1 不同年龄组男性精液参数、精浆活性氧水平和精子DNA损伤的比较(±s)

表1 不同年龄组男性精液参数、精浆活性氧水平和精子DNA损伤的比较(±s)

＊与＜35岁组比较P＜0.05 #与35～39岁组比较P＜0.05

组别 n 精液量(ml)密度(×106/ml)a+b级(%)精子正常形态(%)MDA浓度(nmol/L)DNA损伤(%)＜35 岁组 40 2.89 ±1.05 72.33 ±38.15 51.50 ±14.33 15.18±7.23 9.26 ±5.41 15.40 ±5.92 35 ～39 岁组 34 2.99 ±1.15 75.47 ±40.69 50.88 ±12.28 15.26 ±8.88 11.37 ±8.54 17.19 ±9.18≥40 岁组 21 2.47 ±1.02 72.29 ±32.83 43.57 ±12.56* 11.55 ±8.48 17.66 ±7.73*# 21.12 ±11.01*

2.2 精浆ROS水平和精子DNA损伤与男性年龄的相关性分析

经Pearson相关系数分析，精浆ROS水平和精子DNA损伤与男性年龄呈明显正相关性(r=0.43，P ＜0.05;r=0.27，P ＜0.05)，随男性年龄增加 ROS水平和精子DNA损伤增加。

3 讨论

长期以来，人们普遍关注女性年龄对生育的影响，35岁后生育能力开始下降，最终导致妊娠率下降和流产率升高［3］。男性生育力可维持到较高年龄，但随着年龄的增加，男性的生殖功能逐渐减退，表现为生殖激素水平的改变和精液质量的下降，遗传风险性增高。随着生育年龄的推迟，研究精子功能与年龄变化显得尤为必要与迫切，氧离子、自由基和过氧化物等活性物质统称为ROS。ROS在生理状态可调节精子的功能，少量持续的ROS是精子受精、获能等生理过程所必需的，但过量ROS造成氧化应激，会导致精子膜损伤，影响精子功能。精子膜含有大量多聚脂肪酸，这一特殊结构使精子膜对ROS的水平变化尤其敏感，极易受到ROS的攻击而发生氧化应激损伤［4，5］。在众多与男性不育有关的因素中，ROS已成为学者们研究的热点。但男性年龄与ROS的相关性研究甚少。精子作为遗传物质的主要传递者，对后代的种族繁衍具有重要意义，精子DNA损伤情况将直接影响精子的质量及下一代的生长发育，DNA双链容易变性成为单链DNA，这些损伤与胚胎着床前发育不良、早期流产率的升高均有关［6］。同时增加遗传性疾病、出生缺陷的易感性，甚至引起子代异常［7］。精子DNA完整性在男性生育中具有重要作用。研究年龄和DNA损伤关系尤为重要。

随着年龄增加，精液一些基本参数发生变化，主要表现为射精量减少、精子活力低下，精子形态正常率随年龄增长有显著降低的趋势。本研究发现≥40岁组前向运动精子百分率较＜35岁组降低，在其它参数如精液量、浓度、正常形态方面未发现差异，可能与样本例数少有关。本研究发现随男性年龄增加精浆ROS水平增加。与Wyrobek等［8］报道无论不育男性还是正常男性，随年龄增长精子DNA氧化应激损伤增加的结果相符合。高ROS可以使精子膜结构的完整性破坏，膜通透性增加，失去了对参与精子运动调控的有关胞内离子浓度的调节能力，导致精子运动能力下降甚至丧失［9］。本文中≥40岁组精子活动力下降，是否与ROS水平增高有关，尚待进一步研究。此外，高水平的ROS可导致DNA单链的形成和双链的断裂，从而影响精子DNA完整性，诱导精子DNA损伤［10］。本研究发现，精子DNA损伤的比率与男性年龄呈明显正相关性(r=0.27，P＜0.05)，随男性年龄增加，精子DNA损伤增加。与Schmid等［11］对80位不吸烟的健康人进行精子DNA损伤检测，结果显示男性年龄增长与精子DNA损伤有关联的结果相符合。此外Vagnini等［12］使用TUNEL法对508例男性精液检测，其发现与男性年龄增长和精子DNA损伤有关联的结果相符合。随着男性年龄的增加，可能会导致精子DNA损伤的增加，因本研究样本例数偏少，精子DNA损伤与年龄的关系还需进一步扩大样本量进行研究。鉴于精子DNA损伤对男性生育的重要性，男性年龄也应引起关注。

精液中的ROS和精浆抗氧化能力保持平衡，当精液中的ROS增加或精浆抗氧化能力减低时，这种平衡被打破，导致氧化应激发生［13］。随着年龄增长，细胞、组织和器官的氧化损伤和抗氧化能力降低，也可能是活性氧增加的一个原因。随着男性年龄增长，睾丸、输精管、前列腺和附睾等生殖器官的器质性改变，可能会影响整个生精过程和精液质量，导致精液质量下降，引起精子DNA损伤增加。父代精子DNA的损伤又与子代儿童癌症的发生有密切关联。新的研究也证明精子DNA损伤与男性年龄以及某些遗传性疾病存在一定关系［14］。Singh等［15］发现年龄增大，精子DNA更易受损且损伤更为严重。高龄对生育能力及后代生长发育的影响是个不容忽视的问题。

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11 Schmid TE，Eskenazi B，Baumgartner A.The effects of male age on sperm DNA damage in healthy non－smokers［J］.Hum Reprod，2007，22(1):180－187.

12 Vagnini L，Baruffi RLR，Mauri AL，et al.The effects of male age on sperm DNA damage in an infertile population［J］.Reprod Bio med Online，2007，15(5)，2007:514－519.

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