辛伐他汀对肝癌SMMC-7721增殖作用的初步研究

杨士杰 姜达

他汀类药物是临床上治疗高胆固醇血症的主要药物。研究发现他汀类药物具有抗肿瘤作用。实验室研究显示他汀类药物可抑制多种肿瘤得增殖，如乳腺癌［1］、结肠癌［2］、胰腺癌［3］、白血病［4］、恶性胶质瘤［5］等。有关他汀类药物对肝癌作用的实验室研究，笔者尚未见国内报道。本实验就他汀类药物对肝癌细胞增殖作用影响做一初步研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料 辛伐他汀为中国药品生物制品鉴定所产品，购自河北省药检所，用乙醇溶解NaOH激活［6］，HCl调节pH值至7.4备用。人肝癌细胞株SMMC-7721购自中国科学院上海细胞存储中心，p21Ras、NF-κB抗体为美国 Santa Cruz Biotechnology产品。

1.2 MTT实验检测SMMC-7721的增殖 取对数生长期的细胞接种于96孔板，待细胞贴壁后，用含辛伐他汀 0、5、10、20 μmol/L培养基作用 24、48、72 h。加入 MTT 继续培养 4～6 h，吸出培养液加入DMSO。于搏赛酶标仪波长570 nm处测定OD值，计算细胞的存活率。每个浓度设3个平行孔。

1.3 流式细胞术测定p21Ras、NF-κB 取对数生长期的细胞，接种于培养瓶，待细胞贴壁后，用含辛伐他汀 0、5、10、20 μmol/L培养基培养48 h。常规洗涤、消化、乙醇固定。取单细胞悬液加入鼠抗人单克隆抗体p21Ras、NF-κB，流式细胞仪检测。并下述公式计算。

1.4 统计学分析应用SPSS 10.0统计软件，计量资料以表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 辛伐他汀对SMMC-7721细胞增殖的影响 MTT比色法分析显示辛伐他汀作用后细胞增殖被抑制，呈现剂量-时间依赖效应。因用乙醇溶解药物，乙醇对照对增殖无影响。见图1。

图1 辛伐他汀对肝癌细胞SMMC-7721抑瘤率

2.2 辛伐他汀对SMMC-7721肝癌细胞核转录因子NF-κB表达的影响 辛伐他汀作用SMMC-772148 h后，NF-κB的FI值分别为(1.00 ±0.02)、(0.95 ±0.01)、(0.86 ±0.02)、(0.74 ±0.02)。表明随着浓度增高，NF-κB表达呈进行性下降(P=0.0001)。见图 2。

图2 辛伐他汀对SMMC-7721细胞NF-κB表达的影响

2.3 辛伐他汀对SMMC-7721肝癌细胞核转录因子cdk2表达的影响 辛伐他汀作用SMMC-772148 小时后，cdk2的FI值分别为(1.00 ±0.01)、(0.94 ± 0.02)、(0.91 ± 0.02)、(0.81 ±0.01)。表明随着辛伐他汀浓度增高，cdk2表达呈进行性下降(P=0.001)。见图3。

图3 辛伐他汀对SMMC-7721细胞cdk2表达的影响

3 讨论

汀类药物是临床上治疗高胆固醇血症的代表性药物，这类药物是胆固醇合成限速酶——羟甲基戊二酸单酰辅酶 A(HMG-CoA)还原酶的抑制剂。他汀类药物结构中的侧链部分与HMG-CoA结构十分相似，和HMG-CoA还原酶的亲和力较HMG-CoA强10000 倍。他汀类药物能显著降低HMG-CoA还原酶活性，抑制其下游产物的合成，后者包括胆固醇、长醇、泛醌、异戊烯腺嘌呤、焦磷酸法呢酯(FPP)等小分子物质，这些小分子物质在细胞内信号传导等多种效应中起到重要作用。

常见的他汀类药物有美伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、辛伐他汀等。在众多的他汀类药物中，大部分药物是其活性形式，在体外具有抗肿瘤活性。只有洛伐他汀和辛伐他汀是无活性的药物前体，需在肝内转化为β-羟基酸形式，才具有活性。在本实验中，我们曾用乙醇溶解的辛伐他汀直接作用于细胞，未观察到细胞增殖受抑。按文献［6］用NaOH激活以后，可以观察到辛伐他汀的抗增殖作用、促凋亡作用以及降低侵袭力作用，并可见到NF-κB、cdk2表达量的改变。

NF-κB广泛存在于细胞中的核转录因子之一，不仅与机体的免疫应答、细胞增殖、生长分化、细胞周期以及凋亡有关，而且与肿瘤的发生发展和侵袭转移有密切关系，其过表达能诱导细胞的恶变［7］。NF-κB尚可作用于细胞周期蛋白 cyclinD1，启动cyclinD1的转录，促使G1、G0期向S期转化，使癌细胞无限增殖［8］。本研究显示辛伐他汀处理SMMC-7721细胞48 h后，能下调细胞中NF-κB的表达水平，且细胞的增值也受到影响。可能是辛伐他汀抑制了NF-κB的表达水平，抑制了肿瘤细胞的无限增值。

细胞增殖通过细胞周期实现的，细胞周期受细胞周期蛋白依赖激酶(cdk)的严格调控。他汀类药物能影响细胞周期进程，阻滞髓样白血病细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞等多种肿瘤细胞于G1期，同时伴有细胞周期蛋白依赖性激酶cdk2、cdk4、cdk6。本实验中，应用辛伐他汀处理肝癌细胞SMMC-772148 hr，可引起cdk2以一种剂量依赖性方式下调。cdk2除在细胞周期中具有重要意义外，还具有Rb蛋白激酶的活性。目前的研究认为，视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)是细胞G1期进入S期的“开关”，Rb有两种形式，即磷酸化的失活形式和失磷酸化的活性形式。活化的cdk2可使Rb磷酸化而失活。失活的Rb同核转录因子E2F家族成员解离，促进S期DNA的合成，加快肿瘤细胞的生长。活化的Rb和核转录因子E2F结合，进而影响下游转录因子和端粒酶的活性，抑制DNA的合成从而发挥抗肿瘤作用。

1 周永，糜漫天，张干勇，等.胆固醇抑制剂洛伐他汀对MCF 7细胞增殖分化功能及形态结构的影响.肿瘤防治研究，2003，30:210-213.

2 Banke A，Sanjay B，Balasz H，et al.Lovastatin augments apoptosis induced by chemotherapeutic agents in colon cancer cells.Clinical Cancer Research，1999，5:2223-2229.

3 Toshiyuki K，Mutsuko M，Teruo I，et al.Inhibition of Epidermal Growth Factor-induced RhoA Translocation and Invasion of Human Pancreatic Cancer Cells by 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A Reductase Inhibitors.Cancer Rrsearch，2001，61:4885-4891.

4 国风，岑建农，陈子兴，等.胆固醇合成抑制剂洛伐他汀对NB4细胞体外作用的研究.中华血液杂志，2002，22:584-587.

5 Jonc CD，Couldwell WT，Hinton DR，et al.Lovastatin induces growth inhibition and apoptosis in human malignant glioma cells.Biochem Biophys Res Commun，1994，205:1681-1687.

6 Marco R，Lorenzo A，Paul M，et al.Pharmacological control of the mevalonate pathway:effect on arterial smooth muscle Cell Proliferation.JPET，1997，281:1144-1153.

7 Shibata A，Naggaya T，Imai T，et al.Inhibition of NF-kappaB activity decreas the VEGF mRNA expression in MDA-MB-231 breast cancer cell.Breast Cancer Res Treat，2002，73:237-243.

8 Hinz M，Krappmann D，Eichten A，et al.NF-κB function in growth contral:regulation of cyclin D1 expression andG0/G1-to–S-phase transition.Mol Cell Biol，1999，19:2690-2698.