自发性高血压大鼠恐惧情绪与内皮舒张功能障碍的相关性

薛一涛 张颖 苏文革 王世军 林海青

近年来，大量对原发性高血压患者的心理障碍研究发现，恐惧、愤怒等不良情绪可诱发高血压，而高血压时内皮细胞损伤，血管活性物质发生改变。内皮素(endothelin，ET)是目前发现最强的缩血管活性肽，一氧化氮(nitric oxide，NO)是内皮衍生舒张因子，二者均为调节血管压力的重要活性物质;血管细胞黏附分子 1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和可溶性细胞间黏附分子1(soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1)在维持内皮细胞的完整性及发挥正常的生物学作用方面具有重要作用。本研究通过复制恐志动物模型，从血管活性物质及胸主动脉形态学变化的角度，直观地揭示恐志对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)内皮舒张功能的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

1.1.1 试剂 本实验NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所;ET试剂盒购自北京普尔伟业生物科技有限公司;sICAM-1及VCAM-1试剂盒购自北京科盈美科技有限公司。

1.1.2 仪器及设备 SN-695型智能放免γ测量仪，上海核所日环光电仪器有限公司生产;DDL-5冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂生产;721分光光度计，上海第三分析仪器厂生产;电热恒温水温箱HWI，北京医疗设备厂生产;全自动洗板机RT-3000、酶标分析仪RT-6000，深圳雷杜公司生产;IB-5离子溅射仪，日本Eiko公司生产;日立S-570扫描电子显微镜，日本日立公司生产。

1.2 实验动物

选择8周龄、雄性SHR 20只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)和8周龄、雄性Wistar Kyoto(WKY)大鼠10只(购自山东中医药大学实验动物中心)作为实验对象，体质量117～135 g。

1.3 实验方法

1.3.1 分组 将WKY大鼠10只设为正常对照组;将20只SHR按简单随机抽样方法分为2组，SHR对照组和SHR恐志组，每组各10只。其中，SHR对照组和WKY组正常饲养，不给予任何刺激因素;SHR恐志组则给予实验性的恐志刺激因素。

1.3.2 模型制作方法 参照刘晓伟等［1］的大鼠恐志模型制作方法，同时参考Takashi方法制备SHR恐志模型。即第9天将SHR单独放入电刺激仪(30 cm×40 cm×40 cm)，四周为玻璃，底部铺设铜栅，通以1 mA交流电，顶部置10 W日光灯照射;前5 min为适应期，后同时给予电击和声音刺激，每次10 s，间隔1 min，共30次。第10、11天重复刺激，同时记录动物处于冻结状态的时间(除外呼吸运动)。本实验中要求抓取动物动作轻柔，避免不必要的刺激干扰实验结果。

1.3.3 行为学检测 SHR恐志组大鼠行为变化:移动缓慢、贴壁，后蜷缩于角落处。听闻声音后表现为静止、呆滞、蜷缩、蹲伏等冻结姿势，期间仅有呼吸和轻微摇摆运动，伴有立毛、肌肉轻微振颤、二便失禁。

1.3.4 指标检测及方法 大鼠干预期结束后，均禁食、不禁水12 h，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，下腔静脉取血，制备血清和肝素抗凝血浆，摘取胸主动脉，保存备用。按照试剂盒说明进行操作，检测血浆NO、血浆ET、sICAM-1及VCAM-1水平;胸主动脉壁内皮细胞的形态学变化情况:新鲜材料用2.5%戊二醛固定12 h后，经乙醇逐级脱水，每级15 min;临界点干燥，粘托镀铂后扫描电子显微镜观察并拍照。

表1 3组神经内分泌指标检测结果(±s)

表1 3组神经内分泌指标检测结果(±s)

注:与WKY组比较，aP＜0.01;与SHR对照组比较，bP＜0.05

组别 大鼠(只) ET(ng/L) NO(μmol/L) VCAM-1(ng/L) sICAM-1(μg/L)WKY组 10 54.700±4.607 44.200±1.733 780.190± 96.0150.340±0.138 SHR对照组 10 66.213±5.420a 35.450±1.435a 942.742±123.127a 0.794±0.243a SHR恐志组 10 71.348±4.764ab 37.020±1.280ab 1040.746±140.803a 0.847±0.192a

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠行为学变化

未进行光电刺激的WKY组大鼠与SHR对照组大鼠比较，冻结状态时间差异无统计学意义［(3.67±0.65)s比(3.95 ±0.58)s，P＞0.05］，而SHR恐志组大鼠较SHR对照组大鼠冻结状态时间(观察3 d，取平均值)明显延长［(10.93±1.38)s比(3.95±0.58)，P＜0.01］，表明光电刺激使 SHR产生恐志倾向，情绪诱导成功。

2.2 大鼠神经内分泌指标及电镜观察结果

2.2.1 神经内分泌指标 WKY组大鼠的ET、VCAM-1、sICAM-1水平较SHR对照组大鼠低，NO水平较SHR对照组高，且差异均有统计学意义(均为P＜0.01);SHR恐志组与SHR对照组相比，ET和NO水平升高(均为P＜0.05)，VCAM-1和sICAM-1水平同样略高(均为P＞0.05);SHR恐志组与WKY组相比，ET、VCAM-1、sICAM-1 水平升高，NO 水平降低，差异均有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

2.2.2 电镜观察结果本实验扫描电镜观察大鼠胸主动脉内皮细胞形态学变化共15只，3组各5只。

WKY组胸主动脉壁内皮细胞的形态学变化:扫描电镜下可以观察到WKY正常大鼠胸主动脉壁内皮细胞(EC)呈单层扁平形，梭状，条带状分布，大小均匀，形态规整，长轴走形与血流方向一致，细胞膜较完整，表面相对较光滑，细胞核区稍隆起，排列整齐而紧密，细胞的宽部与相邻细胞的窄部镶嵌排列，细胞间隙小，连接处有较矮的嵴(图1、图2)。

图1 WKY对照组4号大鼠胸主动脉壁内皮细胞形态(×600);图2 WKY对照组4号大鼠内皮细胞形态(×2000);图3 SHR对照组2号大鼠胸主动脉壁内皮细胞形态(×600);图4 SHR对照组2号大鼠内皮细胞形态(×2000);图5 SHR对照组1号大鼠胸主动脉壁内皮细胞形态(×600);图6 SHR对照组1号大鼠内皮细胞形态(×2000);图7 SHR恐志模型组2号大鼠胸主动脉壁内皮细胞形态(×600);图8 SHR恐志模型组2号大鼠内皮细胞形态(×2000)

SHR对照组胸主动脉壁内皮细胞的形态学变化:扫描电镜下观察SHR对照组大鼠的胸主动脉壁内皮细胞的形态及结构均有不同程度的变化，轻者内皮细胞基本上仍呈梭形，排列欠佳，细胞膜呈条状撕脱(图3、图4);重者细胞皱缩变小，多呈不规则形，细胞膜损伤明显，甚至脱落，并可见到内皮下层的裸露区，细胞大小不均匀，无沉积物，细胞排列不规则，无明显方向性，间隙较正常明显变大(图5、图6)。

SHR恐志模型组胸主动脉壁内皮细胞的形态学变化:扫描电镜下，可以观察到恐志模型组大鼠胸主动脉壁内皮细胞排列极度紊乱，大小不一，整个细胞失去原有的表面形态，细胞损伤严重，脱落较彻底，在损伤较严重的区域，内皮细胞大片脱落，内皮层表面沉积物较多，被粗细不等，交错成网的纤维状物质包裹(图7、图8)。

3 讨论

3.1 血管内皮相关活性物质研究

ET是一种肽类缩血管物质，分为 ET-1、ET-2、ET-3 3种亚型，其中ET-1是目前发现最强的缩血管活性肽。NO是一种自由基及内源性松弛因子，它是维持血管基础张力的重要生理调节物质，是独立于交感神经和肾素-血管紧张素之外的血压调节因子［2-3］。研究表明，二者是维持血管基础张力的主要活性物质，相互拮抗，相互影响，维持基础血压。血管内皮细胞功能失调导致NO、ET合成与代谢的紊乱，参与许多心血管疾病的发生及发展，其中高血压是最重要的疾病。VCAM-1和sICAM-1同为细胞黏附分子中免疫球蛋白超家族成员，参与不同细胞间的识别和黏附［4］。有研究表明，原发性高血压时白细胞与血管内皮细胞黏附增加以及内皮细胞功能紊乱和内皮损伤，还可促进内皮细胞和白细胞表面黏附分子的表达［5］。

3.2 血管内皮层与扫描电镜的相关研究

扫描电镜主要是用来观察内皮细胞的形态及表面结构的变化，尽管它不能直接测定内皮细胞的功能，但细胞的功能是建立在细胞结构的完整上的，因此我们可以通过观察内皮细胞的结构来推测内皮细胞的功能［6］。国内外也有学者研究压力对血管内皮细胞的损伤，但关于恐志刺激后高血压者内皮细胞形态及形成原因的相关研究较少。

3.3 方法选择依据

本实验是在参照Takashi方法并改良愤怒大鼠应激模型建立方法，即通过间断、低频、低压交流电电击大鼠足底，使动物反复受到刺激，结合同步闪电照射，2 d后大鼠可产生恐惧心理和行为，表现为长时间的静止和蜷缩等。冻结姿态能够客观、有效地反映动物的恐惧情绪水平。此模型为国内外常用的恐惧情绪动物模型，有效排除躯体刺激干扰，且量化评定方法直观、可靠［7］。

3.4 检测结果分析

3.4.1 NO、VCAM-1、sICAM-1 结果分析 在本实验中，SHR光电刺激后NO水平较刺激前增加(P＜0.05)，与刘成伟等［7］、叶林书和朱桐春［8］的研究结果相符合，目前推测可能是早期高血压由于ET的水平增高，促进了NO的释放，为机体保护性的代偿反应，以拮抗ET的收缩血管的作用，本实验结果表明早期高血压ET与NO水平呈显著正相关;另一方面，也可能是由于在不同的血管中NO活性不同，各类血管NO的基础释放量、血管对NO释放促进因素的敏感性、血管受体的反应性以及血流速度不同所造成的，此外还可能与样本量不足有关，具体的体制有待进一步研究。

而VCAM-1和sICAM-1虽增高，但差异无统计学意义(均为P＞0.05)，考虑可能是因为VCAM-1和sICAM-1广泛分布于内皮细胞、淋巴细胞、单核细胞等表面，正常情况下很少表达或是不表达，当受到各种刺激因素诱导后可大量表达，并且与高血压的严重程度呈正相关。血清VCAM-1和sICAM-1的产生可能是依赖内皮细胞激活而持续不断地合成并且停留在内皮细胞表面，直到脱落进入血液循环所形成的，但是这需要一个生理过程及一定的时间做出反馈，本实验可能由于刺激的时间及强度不足，机体未作出充分的反馈调节，也可能与样本量过小有关，具体原因需要更进一步的研究。

3.4.2 电镜观察结果分析 通过扫描电镜观察，正常大鼠胸主动脉内皮细胞的这种排列有利于血液的流动，可以最大限度地降低血流阻力。本实验对照组内皮细胞形态的电镜观察结果与以往的文献记载相符［9-10］。随着血压的增高，5只SHR的内皮细胞的形态及结构较对照组均有不同程度的变化，表明高血压内皮细胞损伤具有个体差异性。血管内皮细胞的形态发生改变，其意义在于适应压力的作用，最大限度地减少其对内皮细胞的损伤，保持血管内皮细胞功能的完整性。给予光电刺激后的SHR恐志大鼠胸主动脉内皮细胞形态学变化显著重于SHR对照组大鼠，分析沉积物的成分可能主要是脱落细胞、细胞碎片和坏死物质，纤维状物质可能是由纤维蛋白、组织碎片等组成，表明细胞损伤较严重，造成大量细胞坏死。形成原因可能是因为予以相应恐志刺激后，在应激状态下SHR血压迅速升高，ET/NO严重失衡，外周阻力增加，加重了内皮细胞的损伤，内皮细胞呈大片状脱落，血液代谢能力下降，血流速度减慢而致。有研究证明，压力刺激可导致血管内皮细胞和血管平滑肌细胞增生、肥大，细胞外基质增生-血管重构等形态和结构的改变，这些改变直接使血管弹性降低，血流阻力增加，血流速度减慢。本实验中SHR恐志组大鼠血管内皮层出现大量纤维状物质，表明恐志刺激等应激状态可引起并加重内皮细胞的损伤和血管通透性增加。液压扩张也可导致内皮细胞损伤，纤维及血小板附着等病理性改变。

根据3组镜下观察的损伤程度，提示内皮细胞的损伤及脱落程度与高血压病变的发展程度呈正相关，并呈进行性发展，是一个由轻变重的逐步发展的过程。因内皮细胞的形态、排列等在体内受诸多因素的影响，生物力学工作者以流体力学的观点及原理认为不同部位的血管内皮壁面不同区域受到血液流动的剪切应力是不同的，在体内脉动流的情况下，血管内皮细胞的不同形态与流体力学作用下所造成的切变应力不同有关，因此，是否恐志高血压大鼠体内其他部位血管内皮细胞也是这种变化需要进一步的研究;此外取材时血管所处的状态、所受的压力等因素均可对血管内皮细胞的形态产生影响，因目前相关研究较少，故有关此方面的资料有待进一步的积累。

本研究结果表明，SHR大鼠神经内分泌功能及血管内皮细胞损伤较WKY大鼠发生明显变化;恐志刺激能延长高血压大鼠的冻结时间，改变高血压大鼠行为，同时可影响高血压大鼠神经内分泌功能，损伤血管内皮细胞。

［1］Liu XW，ZhangHM， QuHD， etal. Establishmentand behavioural evaluation of animal model with Qi injured by anger and fear in TCM.Chinese Journal of Behavioral Medical Science，2006，15:10-11.(in Chinese)

刘晓伟，张红梅，曲宏达，等.中医怒恐伤气动物模型制作及行为评估.中国行为医学科学，2006，15:10-11.

［2］Zhang C.The change of plasma ET and serum NO in different patterns of traditional chinese medicine (TCM)with Hypertension patients.Mastergraduate students'graduation thesis.Changsha:the University of Central South，2005:11-12.(in Chinese)

张臣.高血压病患者不同中医证型血浆ET和血清NO的变化:［硕士研究生毕业论文］.长沙:中南大学，2005:11-12.

［3］Zhao SH，Gao HQ，Qiu J.Research progress of Profilin-1 in endothelial function.Chin J Geriatr，2011，30:784-787.(in Chinese)

赵韶华，高海青，邱洁.前纤维蛋白-1对内皮功能影响的研究进展.中华老年医学杂志，2011，30:784-787.

［4］Cai X，Geng LH，Wang XL，et al.The effects of sICAM-1 on hypertensive disorder complicating pregnancy.Journal of Xinjiang Medical University，2005，28:50-52.(in Chinese)

蔡霞，耿丽红，王晓岚，等.sICAM-1与妊娠期高血压疾病发病的关系.新疆医科大学学报，2005，28:50-52.

［5］Li XB，Hong YD.The research of the relationship between abnormal level of adhesion molecules in hypertension and the syndrome of phlegm damp.Jiangsu Journal of Traditional Chinese Medicine，2005，26:15-16.(in Chinese)

李小兵，洪永敦.高血压患者黏附分子水平异常与痰湿证关系的探讨.江苏中医药，2005，26:15-16.

［6］Liu H，Feng CM.Observation of corneal endothelial cells in modified mid-term preservation by scanning electronic microscope.Eye Science，1995，11:188-191.(in Chinese)

刘华，冯春茂.改良中期保存法角膜内皮细胞的扫描电镜观察.眼科学报，1995，11:188-191.

［7］Liu CW，Chen LP，Li ZY，et al.Significance of plasma endothelin and nitric oxide concentration in the hypertensives and their descendants.Journal of Clinical Cardiology，2002，18:122-124.(in Chinese)

刘成伟，陈力平，李子渊，等.有遗传史的原发性高血压患者子代血浆内皮素和一氧化氮浓度的比较性研究.临床心血管病杂志，2002，18:122-124.

［8］Ye LS，Zhu TC.The measurement and clinical significance of NO，ET，anti-endothelial cell antibody，and antimyocardial antibodies in patients with essential hypertension.Journal of Chinese Physician，2001 Supplement:6-7.(in Chinese)

叶林书，朱桐春.原发性高血压患者血浆一氧化氮、内皮素、抗内皮细胞抗体和抗心肌抗体检测及其临床意义.中国医师杂志，2001增刊:6-7.

［9］Zhang DW，Jin X，Meng H，et al.Scanning electromicroscopic observation on arterial endothelial cells in animal model with thromboangitis obliterans.Chinese Journal of Surgery of Integrated Traditional and Western Medicine，2002，8:74-77.(in Chinese)

张大伟，金星，孟红，等.血栓闭塞性脉管炎动物模型的动脉内皮细胞的扫描电镜观察.中国中西医结合外科杂志，2002，8:74-77.

［10］Zhang HQ，SunAJ， Wang KQ， et al. Scanning electron microscope observation of endothelial cells of different rabbit vascular segments.Chinese Journal of Clinical Anatomy，2004，27:273-276.(in Chinese)

张红旗，孙爱军，王克强，等.兔不同血管段内皮细胞的扫描电镜观察.解剖学杂志，2004，27:273-276.