大黄酸对正常和氧化损伤内皮细胞的增殖和氧化保护作用

钟先锋，罗 婷，邓泽元,*，刘 蓉，范亚苇

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471000)

大黄酸对正常和氧化损伤内皮细胞的增殖和氧化保护作用

钟先锋1,2，罗 婷1，邓泽元1,*，刘 蓉1，范亚苇1

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471000)

目的：观察大黄酸对正常和氧化损伤的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的影响。方法：建立H2O2氧化损伤模型，采用不同浓度的大黄酸对内皮细胞进行处理，检测内皮细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率、丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)活力和超氧化物歧化酶(SOD) 活力及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力的变化；采用流式细胞术研究内皮细胞的凋亡情况，探讨大黄酸对内皮细胞的保护作用。结果：大黄酸浓度在16μmol/L以下时，对HUVEC的增殖无显著性影响；浓度在2μmol/L以上时，减轻HUVEC受到氧化损伤的程度，对氧化性损伤具有保护作用；同时降低了LDH释放率，下调了MDA含量，提高了NO含量和NOS、SOD、GSH-Px的酶活力，显著减少了细胞凋亡率。结论：HUVEC经2～16μmol/L大黄酸处理，可以有效减轻H2O2对其造成的氧化损伤，维持正常的生理形态。

大黄酸；氧化损伤；内皮细胞；增殖

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心血管系统中常见的病理过程[1]。现已得到广泛公认的是AS的形成是由于各种损伤因素(氧自由基、高血压、胆固醇低密度脂蛋白等)作用于血管内皮细胞(endothelial cell，EC)，导致内皮细胞功能障碍并进一步表达和释放各种活性物质及黏附分子共同参与的慢性炎症过程[2]。氧自由基等损伤因素存在于人类血浆及动脉斑块中，对内皮细胞有较强的损害作用。氧化损伤内皮细胞的机制包括通过细胞毒性作用损伤内皮细胞，引起内皮细胞功能障碍和通透性增高，细胞膜内外物质组成和比例发生变化，改变血管的生理作用，使血管对一些因子失去反应；而且氧化损伤产生过量脂质过氧化物能使血管内皮细胞坏死，增强脂质蛋白对动脉壁的通透性；另外，通过各种途径导致体内NO大量失活，从而减弱NO清除超氧化物的作用，进一步引起氧化，从而加重了氧化应激对血管内皮的损伤。内皮细胞损伤是AS的形成和发展的始动环节[3]，为了预防和治疗AS，减少内皮细胞接触损伤因素的机会是至关重要的，故进行早期逆转内皮细胞氧化损伤导致的功能障碍对AS的发病具有积极的预防作用。

大黄酸(rhein)是我国芦荟、大黄等传统中药的主要功效成分，属单蒽核类1,8-二羟基蒽醌衍生物，含有2个羟基和1个羧基，极性强，具有电化学氧化还原性质[4]。大黄酸及其衍生物(如大黄酸鬼臼毒素、赖氨大黄酸、大黄酸-N-β-羟乙基替加氟酯)具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、泻下、肾保护、影响心血管系统以及调脂等生理功能[5-7]。

本研究以培养的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)为材料，观察大黄酸对HUVEC增殖的影响，探讨大黄酸对损伤后HUVEC的保护作用。旨在筛选干预血管内皮细胞功能障碍的功效成分，从多路径探讨其作用的分子生物学机制，为预防和治疗血管内皮功能障碍提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人脐静脉血管内皮细胞株由南昌大学医学院提供；大黄酸购自中国药品生物制品检定所，批号：110757-200206。

DMEM干粉培养基、胎牛血清 美国Gibco公司；胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT) 美国Sigma公司；LDH、MDA、NOS、NO、SOD、GSH-Px试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

XSP-300显微镜 上海蔡康光学仪器公司；MK3酶标仪 芬兰Thermo Multiskan公司；SW-CJ系列洁净工作台 苏州净化设备工程有限公司；CO2培养箱 日本三洋电气公司；N15型台式高速冷冻离心机 香港Heal Force公司；流式细胞仪 美国Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

取人脐静脉血管内皮细胞株复苏，接种于50mL培养瓶内，待生长铺满后，经2.5g/L胰蛋白酶消化传代，放置于37℃、体积分数5%的CO2培养箱培养，正常培养3～4代后分组实验。

1.3.2 大黄酸对HUVEC增殖的影响(MTT法)

将80%融合生长的HUVEC以胰蛋白酶消化液消化，收集细胞，接种于96孔板。正常培养24h后，用磷酸缓冲液(PBS)洗去未贴壁细胞。换用无血清的培养基继续培养8h，使细胞同步化。然后换用含5%胎牛血清和不同浓度大黄酸的DMEM培养液培养，其中1～6组大黄酸的浓度分别为64、32、16、8、4、2μmol/L，每组6个复孔，设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜(DMSO))，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO)，每组设定4复孔。培养24h后，移出培养液，换入无血清DMEM培养液100μL/孔，并于每孔加入5g/L MTT 10μL。继续培养4h后，吸弃原培养液，每孔中加入DMSO 150μL，置摇床上低速振荡10min，使结晶充分溶解，并用酶标仪490nm波长处检测光密度(OD)值。定义对照组细胞存活率为100%，其余各实验组细胞存活率按公式(1)计算。

1.3.3 大黄酸对HUVEC损伤的保护作用

将细胞分为对照组、H2O2组(200μmol/L H2O2)和大黄酸组(1～16μmoL/L大黄酸+200μmol/L H2O2)。前期实验操作同1.3.2节，加入不同浓度的大黄酸后，培养24h，加入200μmol/l H2O2作用6h。然后换入无血清DMEM培养液100μL/孔，并于每孔加入5g/L MTT 10μL。继续培养4h后，加入二甲基亚砜DMSO 150μL，用酶标仪490nm波长处检测OD值，按照式(1)计算细胞存活率。

1.3.4 测定大黄酸对内皮细胞LDH、MDA、NOS、NO、SOD、GSH-Px的影响

使用南京建成生物工程研究所L D H、M D A、NOS、NO、SOD、GSH-Px试剂盒测定每组HUVEC的各项指标。

1.3.5 流式细胞仪检测内皮细胞凋亡

实验分组同1.3.3节，不同处理的HUVEC用不含EDTA的胰蛋白酶消化，PBS洗涤2遍，加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞，使用5μL异硫氰酸荧光素(FITC)和5μL碘化丙啶(PI)在室温避光反应10min，在1h内进行流式细胞仪的观察和检测。

表1 大黄酸对人脐静脉内皮细胞LDH、MDA、NOS、NO、SOD、GSH-Px的影响Table 1 Effect of rhein on LDH, MDA, NOS, NO, SOD and GSH-Px in HUVECs

2 结果与分析

2.1 大黄酸对HUVEC增殖的影响

图1 不同浓度大黄酸对HUVEC增殖的影响Fig.1 Effect of rhein on the proliferation of HUVECs

由图1可知，大黄酸浓度在16μmol/L及以下时，对HUVEC的增殖无显著性影响，而达到32μmol/L时，对内皮细胞呈现一定的细胞毒性，故选择大黄酸的添加浓度在16μmol/L以下，以此排除大黄酸对HUVEC的毒性损伤。

2.2 大黄酸对HUVEC氧化损伤的保护作用

图2 不同浓度大黄酸对HUVEC氧化损伤的保护作用Fig.2 Protective effect of rhein on oxidative damage of HUVECs

由图2可知，HUVEC经200μmol/L H2O2氧化损伤后，细胞存活率为76.3%，而在大黄酸浓度在2、4、8、16μmol/L时，内皮细胞的存活率分别为79.0%、81.1%、83.3%、89.5%，均有显著保护HUVEC免受氧化损伤作用。

2.3 大黄酸对内皮细胞LDH、MDA、NOS、NO、SOD、GSH-Px的影响

由表1可知，对照组和H2O2组相比较，LDH的释放率和MDA含量分别从36.5%、26.15nmol/mg pro上升到54.9%、42.38nmol/mg pro；而NOS酶活力、NO含量、SOD酶活力以及GSH-Px酶活力含量则由3.99U/mg pro、65.67μmol/L、120.08U/mg pro、151.82U/mg pro下降为1.84U/mg pro、24.64μmol/L、45.43U/mg pro、80.16U/mg pro。

比较大黄酸不同浓度组，发现随着大黄酸浓度的增大，LDH的释放率和MDA含量呈现下降趋势，当大黄酸浓度大于4μmol/L时，LDH的释放率和MDA含量与H2O2组相比，有显著性差异。

对SOD、NOS、NO、GSH-Px这些指标的检测结果显示，HUVEC经过H2O2处理后，SOD酶活力、NOS酶活力、NO含量、GSH-Px酶活力均产生显著降低，说明大黄酸对细胞造成了显著的氧化性损伤，而加入大黄酸进行预防性保护后，NOS酶活力、NO含量、SOD酶活力、GSH-Px酶活力都出现不同程度的回升。测定结果提示HUVEC经大黄酸预处理，可以有效减轻H2O2的氧化损伤，保护细胞免受更大的氧化性损伤。

2.4 流式细胞仪检测HUVEC凋亡

图3 FITC-PI通道的二维散点图Fig.3 Bivariate graphs for the FITC-PI fluorescent resolution of EC

由图3可知，HUVEC经H2O2氧化损伤后，41.7%的细胞进入早期凋亡，2.1%的细胞进入晚期凋亡或者坏死，而16μmol/L大黄酸处理后，有21.1%的细胞进入早期凋亡，0.7%的细胞进入晚期凋亡或者坏死，提示大黄酸可以保护HUVEC免受氧化损伤，降低细胞凋亡率，维持正常生理功能。

3 讨 论

3.1 内皮细胞氧化损伤模型和药物作用范围的选择

人体内代谢的各种反应，大多会产生自由基，其中以O2-·产生最快[8]。氧自由基可作用于内皮细胞细胞膜，引起链式过氧化反应，产生许多脂质过氧化物。脂质过氧化物不仅会损伤细胞DNA，诱导内皮细胞凋亡和坏死，而且可以作为非常重要的信使分子，介导各种各样凋亡信号转导。血管内皮细胞的过度凋亡在动脉粥样硬化、冠状动脉综合症等心血管疾病发生发展中起关键作用[9]。抑制氧自由基诱导的血管内皮细胞过度凋亡是心血管疾病防治的重点环节，而大黄酸有抗氧化和防治心脑血管病的作用[10]。建立细胞氧化损伤模型，多采用H2O2、ox-LDL、乙醇等试剂，本实验利用H2O2产生O2-·来建立内皮细胞损伤模型，因为该系统较为稳定科学，简便易行，适用于筛选药物。综合文献和实验室数据分析，实验采用200μmol/L的 H2O2诱导内皮细胞损伤。

大量人工或者天然的食物和药物对细胞都有细胞毒性，在研究各种药物对细胞的保护作用时，应设法排除毒性对细胞的影响。大黄酸浓度在大于32μmol/L时，对人脐静脉内皮细胞的增殖产生抑制作用，有显著性差异。所以设计了添加1～16μmol/L的大黄酸作为药物组浓度的实验方案。

3.2 大黄酸保护HUVEC免受氧化损伤的机制

AS的发生是由于血管内皮细胞和平滑肌细胞受各种危害因素损伤[11]，使血管壁局部产生的过度慢性炎性反应，是细胞受损后的一种保护性反应，如果损伤加重，则会造成过度的炎性纤维增生性反应，最终导致动脉管腔的堵塞。有研究表明，内皮细胞的再生和增殖作用是动脉粥样硬化的修复的关键环节[12]。

大黄酸(大于2μmol/L)可以增强内皮细胞抵御H2O2氧化损伤的能力，这可能与大黄酸具有较强的氧化还原能力有关。对LDH、MDA、SOD、NOS、NO、GSH-Px的测定结果也证实了这点。

LDH释放率受H2O2氧化损伤的影响升高，这可能是因为细胞损伤时细胞质内氧依赖性酶及细胞膜结构受到影响，细胞膜通透性显著提高，细胞内的LDH产生增加，同时向细胞外的漏出也相应增加。LDH释放率反映了细胞膜受损伤的程度，是评估细胞损伤重要指标之一。MDA也是评估体内脂质过氧化程度的重要指标之一，间接反应细胞损伤的在体内的自由基可以通过链式反应，放大活性氧的危害[13]。大黄酸促进了NOS和NO的分泌量，而NOS和NO是维持血管正常生理功能的重要活性物质，是具有双重作用的体内局部调节因子，与细胞的增生和分化有关，能清除体内自由基。大黄酸也促进了SOD和GSH-Px的分泌量，SOD能消除人体在吸收代谢过程中生成的有毒有害物质，人体不断地补充 SOD具有抗衰老的特殊效果[14]，可以维持细胞内的氧化还原状态的平衡；GSH-Px主要生理功能是清除自由基、抗氧化、抗衰老，可消除H2O2产生自由基而损伤细胞膜的危害，同时GSH-Px还可以提高人体免疫力，增进血球制造保护物质的功能，保护身体免受感染，降低细胞制造发炎物质的总量。

血管的增生除了与血管内皮细胞的增殖有关外，还受血管内皮细胞凋亡的影响[15]。细胞凋亡导致细胞核内的DNA因漏出而减少，故在流式细胞仪图形上，出现凋亡细胞峰。H2O2组细胞因氧化损伤大量凋亡，加入大黄酸预处理后，大大减少了凋亡率，保持了内皮细胞的正常活力和生理功能。

综上，大黄酸在2～16μmol/L浓度条件下，无显著细胞毒性；内皮细胞经H2O2处理后，细胞膜氧依赖性酶及细胞膜结构受到影响，细胞膜通透性显著提高，LDH释放率、MDA含量显著升高，NOS、NO等活性物质和重要因子分泌量减少，SOD、GSH得不到补充，自由基清除能力下降，细胞凋亡率上升。大黄酸预处理后，因为大黄酸本身的氧化还原能力，同时改善了内皮细胞的增殖情况，减少了LDH释放率，抵御了细胞的过度脂质过氧化，NOS、NO、SOD、GSH等活性物质的分泌量回升，防止细胞发生凋亡，维持了细胞正常的生理形态，保护了内皮细胞，阻止AS的发生和发展。

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Proliferative and Protective Effects of Rhein on Normal and Oxidatively Injured Endothelial Cells

ZHONG Xian-feng1,2，LUO Ting1，DENG Ze-yuan1,*，LIU Rong1，FAN Ya-wei1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471000, China)

Objective: To study the effect of rhein on the proliferation and oxidative damage of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Methods: An oxidative injury model was established with H2O2. HUVECs were incubated with rhein at various concentrations and the availability of rhein for protecting endothelial cells was explored. The release rate of lactic acid dehydrogenase (LDH), the contents of malondialdehyde (MDA) and NO, and the activities of nitrogen oxide synthase (NOS), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were determined. Flow cytometry was employed to investigate the apoptosis of HUVECs. Results: Rhein had no obvious effect on the proliferation of HUVECs when the concentration of rhein was less than 16 μmol/L. However, rhein at a concentration of more than 2 μmol/L could reveal significant protection against oxidative damage in HUVECs. The release rate of LDH and the content of MDA revealed an obvious decrease, whereas the content of NO and the activities of NOS, SOD and GSH-Px exhibited an obvious increase. The rates of apoptosis and necrosis were reduced significantly. Conclusion: Rhein can maintain the normal physiology of the cells and prevent the cells from H2O2-induced injury at a concentration of 2—16 μmol/L. It is particularly important for the prevention and treatment of atherosclerosis.

rhein；oxidative damage；endothelial cells；proliferation

R151

A

1002-6630(2012)11-0257-05

2011-06-29

江西省研究生创新专项资金项目(YC10A016)；食品科学与技术国家重点实验室自由探索课题(SKLF-TS-200921)

钟先锋(1981—)，男，讲师，博士研究生，研究方向为抗动脉粥样硬化药物筛选。E-mail：zhongxf81@126.com

*通信作者：邓泽元(1963—)，男，教授，博士，研究方向为脂肪与健康。E-mail：dengzeyuan28@yahoo.com.cn