人工接种发酵甘蓝工艺条件的优化

燕平梅，赵文婧，宋敏丽，吴丽花，陈燕飞，张 腾

(太原师范学院生物系，山西 太原 030031)

人工接种发酵甘蓝工艺条件的优化

燕平梅，赵文婧，宋敏丽，吴丽花，陈燕飞，张 腾

(太原师范学院生物系，山西 太原 030031)

为了探究甘蓝人工接种发酵适宜的发酵剂及发酵条件，采用从四川泡菜老汤中分离的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)3种菌以单一和不同配比混合组合成16组组合发酵剂中选出发酵甘蓝时亚硝酸盐含量低、发酵速度快、风味好的发酵剂。结果表明：肠膜明串珠菌、戊糖乳杆菌，其质量比为1:2(nPb:SPc组合)，肠膜明串珠菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌，其质量比为1:1:1(nPb:bC1:SPc组合)，此两种组合为较优化发酵剂。应用响应面分析法优化此两种组合发酵剂接种发酵甘蓝的工艺条件。人工接种发酵甘蓝的条件为食盐质量浓度4g/100mL、接种量0.2%、发酵温度25℃。通过主效应分析说明食盐质量浓度对总酸度影响最大，发酵温度次之，接种量对其影响较小。

人工接种发酵；蔬菜；乳酸菌；响应面分析法

蔬菜自然发酵过程中，以乳酸菌的活动贯穿发酵的全过程。不同乳酸菌在发酵中呈现一定消长规律[1-3]。发酵初期主要是肠膜明串珠菌等异型发酵乳酸菌为主的发酵阶段，此时它的数量多、且生长繁殖速度快，但是它对酸的敏感性较强，随着发酵的进行很快死去，随后短乳杆菌、植物乳杆菌成为发酵的优势菌，快速生长繁殖产生大量乳酸，最后由耐酸的植物乳杆菌等同型发酵菌完成发酵。因此蔬菜发酵过程分发酵初期、中期、后期3个阶段，发酵初期主要进行异型发酵，代谢产物有乳酸、醋酸、二氧化碳等，此时为产气阶段，发酵中期既有异型发酵、又有同型发酵，后期主要进行同型发酵，代谢产物主要为乳酸，是不产气阶段。

为了能更好地控制蔬菜发酵，人们在泡菜纯种发酵生产方面进行了大量研究。一些研究者模拟自然发酵蔬菜过程中乳酸菌的消长变化规律，以异型乳酸菌和同型乳酸菌混合为发酵剂发酵蔬菜。生产中采用肠膜明串珠菌、短乳杆菌、植物乳杆菌的混合接种，最终产品质量与不接种生产的产品质量相比无太大变化[4-6]。但是，有时接种后的生产要优于未接种的生产[7-8]，有时相反。沈国华等[9]为异型发酵和同型发酵乳酸菌之间的恰当比例对生产优质泡菜是必需的[9]，但目前这一比例尚不清楚。沈国华等[9-10]进行了采用植物乳杆菌或干酪乳杆菌单加或以1:1的比例混合的蔬菜接种发酵。蒋和体[11]则认为植物乳杆菌与干酪乳杆菌为3:1比较合适。研究结果差异性存在的可能是由于蔬菜原料不同、处理方式不一样、发酵条件不同，所选菌种不同所致。

本实验以从四川泡菜老汤中分离的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)3种菌以单一和不同配比混合组合成16组组合的发酵剂发酵甘蓝，通过测定发酵速度、产酸、亚硝酸盐含量及感官评定选择优良的发酵菌株的配比形式，作为甘蓝发酵的发酵剂，并研究此发酵剂接种发酵甘蓝的最适发酵条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘蓝来自中国农业大学附近的菜市场。本实验所用的乳酸菌是从四川泡菜老汤和泡菜卤中分离所得，包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，编号bC1)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus，编号SPc)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides，编号nPb)。

乳酸、醋酸(均为色谱纯) 美国Sigma公司；对氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺(分析纯) 北京化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

SCL-10AVP高效液相色谱仪、UVmini-1240紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；F-23 pH计 日本 Horiba有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵剂和接种发酵甘蓝的制备

冰箱保存菌→转接活化→扩大培养(30℃培养20h左右)→ 4000r/min离心5min → 称质量

称取50g冲洗干净沥干的甘蓝，放入灭菌的三角瓶中，加入质量浓度5g/100mL食盐水100mL煮沸凉到室温，接入乳酸菌发酵剂，30℃培养箱中厌氧发酵。

1.3.2 发酵菌种组合

将3株菌种按表1接种到发酵甘蓝中，于30℃条件下发酵，定期取发酵甘蓝测亚硝酸盐含量，取发酵菜汁测pH值和可滴定酸，并比较感官的不同。

表1 发酵剂筛选试验处理Table 1 Single strains and their combinations

1.3.3 发酵甘蓝中亚硝酸盐和可滴定酸的测定

可滴定酸的测定：由0.1mol/L氢氧化钠滴定，酚酞为滴定终点指示剂[12]；泡菜卤pH值测定：用数字pH计，pH计的校准用厂商供给的pH值为4.0和7.0的标准缓冲溶液；亚硝酸盐的测定：按GB/T 5009.33—1996《食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定方法》测定[13]。

1.3.4 乳酸和醋酸相对比值的测定

采用HPLC法：色谱系统包括：LC-10AT溶剂输送泵、SPD-10AVVP紫外检测器、CTO-10AVVP柱温箱、DG12A自动脱气机、SCL-10AV系统控制器、C-R8A积分仪。

色谱条件：色谱柱：Lichrosper 100RP-18(4.6mm×25cm，5μm)；流动相：0.5%磷酸氢二铵；流量：1mL/min；检测波长：214 nm；柱温：4 0℃；进样量：20μL；分析时间：10min。

1.3.5 感官指标评定

综合评分时，按加权系数：颜色25%、滋味25%、香气25%、质地25%，满分100(表2)，每次评分请消费者10人，实验前不接触或避免使用有气味的化妆品、洗涤剂，避免感受器官受强烈刺激，于实验区对发酵甘蓝作出评价。记录数据分析，判断处理间差异显著性。

1.3.6 发酵条件对发酵甘蓝pH值和可滴定酸的影响

1.3.6.1 不同温度条件下发酵剂发酵甘蓝实验

筛选出的两组优良发酵剂以0.10%的接种量接入到质量浓度4g/100mL食盐的发酵甘蓝中，分别于15、20、25、37℃温度条件下发酵，定期取甘蓝卤测pH值和可滴定酸。

表2 甘蓝发酵产品感官指标评分标准Table 2 Standards for sense evaluation of fermented cabbage

1.3.6.2 不同接种量对发酵速度的影响

以nPb:SPc组合为接种材料，以不同的接种量接种到质量浓度4g/100mL食盐的发酵甘蓝中，于25℃发酵，定期测发酵菜液的pH值和可滴定酸度。从经济和发酵速度考虑选择合适的接种量。

1.3.6.3 不同质量浓度食盐对发酵的影响

以nPb:SPc组合为接种材料，接种量为0.10%，取不同质量浓度食盐的发酵甘蓝于25℃发酵，定期测发酵菜液的亚硝酸盐含量。从发酵蔬菜的安全性和和发酵速度考虑选择合适的盐质量浓度。

1.3.7 发酵条件的优化试验及最佳发酵模式的建立

表3 三因素二次正交旋转回归试验设计Table 3 Factor and levels of quadratic orthgonal rotary regression design

采用响应面分析法，因素水平编码见表3。在单因素试验基础上，以发酵甘蓝的总酸度为指标，以发酵温度、接种量、食盐质量浓度3个因素为自变量，设计三因素三水平共15个试验点的响应面分析试验，优化人工接种发酵甘蓝的工艺条件。

1.3.8 统计分析方法

采用SAS 8.0软件进行方差分析和中心组合设计分析。

表4 不同菌种组合的发酵剂接种发酵甘蓝总酸变化情况Table 4 Total acidity changes in fermented cabbage brine during fermentation

2 结果与分析

2.1 优良发酵剂的筛选

2.1.1 不同菌种组合发酵甘蓝亚硝酸盐含量的变化

图1 菌种组合1～8发酵甘蓝菜中亚硝酸盐含量的变化Fig.1 Change in nitrite concentration in fermented cabbage during fermentation

图2 菌种组合9～16发酵甘蓝菜中亚硝酸盐含量的变化Fig.2 Change in nitrite concentration in fermenting cabbage during fermentation

图1 、2表示16组发酵剂发酵甘蓝中亚硝酸盐含量变化情况，组合2和组合3发酵甘蓝菜中亚硝酸盐含量较其他组合高，组合1在发酵初期亚硝酸盐含量较低，而发酵第5天亚硝酸盐含量较其他组合高。因此，从亚硝酸盐含量高低考虑，组合1～3这3种单一菌种不适宜作发酵剂。组合4～16为混合菌种发酵剂，发酵甘蓝菜中亚硝酸盐含量较组合1～3单一菌种低，组合7、14、15、16发酵甘蓝亚硝酸盐含量较其他混合组合高，未被作为发酵剂的候选对象。

2.1.2 不同菌种组合发酵甘蓝产酸和pH值变化情况

由表4可知，单一菌组合1～3发酵初期，pH值下降较混合菌组慢，产酸慢。中、后期pH值和总酸度变化情况与混合菌组合无明显差异。说明混合菌启动发酵的作用强于单一菌种。含nPb菌的组合发酵初期 pH值下降速度较快，产酸较快，中、后期与不含nPb菌的组合无明显的区别，说明nPb乳酸菌在初期生长旺盛，对发酵产酸起重要作用。

表5 不同菌种组合的发酵剂接种发酵甘蓝产酸情况和品质比较Table 5 Acid production and sensory quality of fermented cabbage

由表5可知，单一菌种发酵时，球菌(nPb)较杆菌(bC1和SPc)产酸少，但前者风味明显优于后者。这与Stamer等[14]使用单一纯乳酸菌发酵生产的酸菜汁风味研究的结果一致。混合菌种为发酵剂时，含球菌(nPb)较不含nPb产酸少，而风味好。含球菌(nPb)混合菌种发酵较单一菌种发酵风味柔和、醇厚丰满。

16组不同菌种组合发酵10d后取发酵甘蓝卤用高效液相色谱分离测定乳酸和醋酸，求其含量比值。结果见表6。蔬菜发酵过程中，以乳酸发酵为主，同时伴有微量醋酸的生成。极少量的醋酸不但无损于腌制品的风味，反而有利于风味的提高，如果醋酸含量过高，会影响制品的风味。乳酸、醋酸与乙醇生成具有芳香气味的酯类物质，给发酵菜增添特有的香味和滋味。发酵过程中乳酸的产量及乳酸与醋酸含量的比值是影响发酵蔬菜风味的重要因素。李基银[15]认为酸度在0.45%～0.8%左右，乳酸与醋酸含量比值在4:1～10:1之间，发酵菜风味好。本实验16组发酵剂中组合8和13发酵甘蓝卤中乳酸与醋酸含量比小于10。其他组合是乳酸含量远远大于醋酸，其味道酸中带臭。

考虑到亚硝酸盐含量、产酸量及风味因素，最终选组合8和13为优良发酵剂，这两种发酵剂是异型发酵乳酸菌与同型发酵乳酸菌的不同配比。

表6 泡甘蓝卤中乳酸与醋酸含量的比值Table 6 Lactic acid-to-acetic acid ratio in fermented cabbage brine

2.2 接种发酵条件的优化

2.2.1 不同温度下优良发酵剂发酵甘蓝产酸情况

发酵剂组合8、13在不同温度条件下发酵甘蓝，pH值和总酸度的变化快慢不一样，在15、20、25、37℃发酵条件下，组合8到达发酵成熟的时间(pH值为3.5)[9]分别为5、3、2、2d。 组合13到达发酵成熟的时间分别为5、3、2、1 d。说明发酵温度越高，达到发酵成熟的时间愈短。反之，发酵温度愈低，到达成熟的时间愈长。温度高的优点为发酵快、生产周期短。缺点是发酵过程难以控制，容易出现过酸，并有异味，杂菌生长旺盛，变味腐败等问题，质量不稳定，风味较差。发酵温度低，不会出现过熟、污染杂菌等现象，且风味好。但发酵速度慢，生产周期长，经济效益低下。为了兼顾产品的品质和效益，选择25℃左右为发酵甘蓝合适温度。

2.2.2 不同接种量对发酵甘蓝产酸和pH值的影响

以nPb:SPc 组合的发酵剂以不同的接种量接入甘蓝中发酵，从结果可知，接种量对发酵的影响很大，接种量高，发酵速度快，产酸多。0.05%和0.1%的接种量甘蓝需2d成熟，0.2%和0.35%的接种量，1d就能成熟。考虑到发酵的速度和经济性，以最大限度地使发酵技术的优势得以发挥，接种量为0.2%左右为最佳选择。

2.2.3 不同食盐质量浓度对接种发酵甘蓝亚硝酸盐含量的影响

从nPb:SPc组合为接种材料甘蓝在不同质量浓度的食盐发酵过程中产生的亚硝酸盐量都有一个高峰期，且高峰期和峰值随食盐质量浓度和蔬菜的种类不同而异。结果表明甘蓝发酵过程中，食盐质量浓度低，“亚硝酸盐峰”出峰早，峰值大；食盐质量浓度高，“亚硝酸盐峰”出峰晚，峰值小。在2g/100mL食盐发酵条件下，“亚硝酸盐峰”出现在第1天，其值为37mg/kg，用4g/100mL食盐发酵条件下，“亚硝酸盐峰”出现在第2天，其值为23mg/kg，用6g/100mL食盐发酵条件下，“亚硝酸盐峰”出现在第3天，其值为11mg/kg。而且，高质量浓度的食盐比低质量浓度的食盐发酵甘蓝中亚硝酸盐含量降低的速度慢。从发酵甘蓝的亚硝酸盐含量和其降低的速度考虑选择4g/100mL的食盐。

2.2.4 nPb:SPc组合发酵模型的建立和统计分析

为了研究不同条件对人工发酵甘蓝的影响和确定最佳的发酵条件，以nPb:SPc组合为接种材料在单因素试验基础上进行中心组合试验，对工艺参数进行优化，试验设计方案和结果见表7，15个试验点分为两类：其一是析因点，自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维定点，共有12个析因点；其二是零点，为区域中心点，零点试验重复5次，用来估计试验误差。

以甘蓝发酵3d的pH值(Y1)和总酸度(Y2)为响应值，经回归拟合后，得到回归方程：

表7 三因素二次正交旋转回归试验设计试验及结果Table 7 Box-Behnken design arrangment and results

表8 pH值为指标的回归方程各项的方差分析表Table 8 Variance analysis for pH value

表9 以总酸度为指标的回归方程各项的方差分析表Table 9 Variance analysis for total acidity

由表8、9可知，结合回归方程的方差分析中的失拟项均方和纯误差均方，对pH值回归方程的失拟性检验F1＝50.65903＞F0.05(3,2)＝19.2，说明差异显著，方程(1)对所有试验点拟合程度较差。总酸度回归方程失拟性检验F2＝17.66813＜F0.05(3,2)＝19.2，差异不显著，失拟性检验不显著，说明总酸度回归方程对所有试验点拟合程度较好。所以对总酸度回归方程进行显著性检验。用回归方程来描述总酸度与自变量的关系时，其非线性关系显著：F1＝13.15608＞F0.05(9,5)＝10.2，差异显著，总酸度回归方程均通过F1、F2检验，说明由二次正交旋转设计所获得的模型能够反映实际规律是有效的。由酸度回归方程可知，一次项回归系数绝对值的大小依次为X3＞X1＞X2，说明食盐质量浓度对总酸度影响最大，发酵温度次之，接种量对其影响较小。

2.2.5 交互作用对人工接种nPb:SPc组合发酵甘蓝总酸度的影响

由图3可知，在温度一定时，随着接种量增加，总酸度先增加后减少。当接种量一定时，随着发酵温度增高，总酸度先增加后减少。适当发酵温度和接种量获得较高的总酸度。由图4可知，接种量(X2)较低时，随着发酵用食盐质量浓度增加，总酸度增大，接种量(X2)较高时，随食盐质量浓度增大，总酸度先高后低。用盐量(X3)较少时，接种量(X2)加大，总酸度随之增高，用盐量(X3)较高时，随着接种量的增大，而总酸度(Y2)减少。较高的接种量和较低的用盐量可以得到较高的总酸度。由图5可知，食盐质量浓度(X3)一定时，发酵温度(X1)增高，发酵总酸度先增加后减少，发酵温度较中心值偏低时，发酵总酸度增加，发酵温度较中心值偏高时，发酵总酸度减少。发酵温度不变时，食盐质量浓度增加，总酸度增大。较低的发酵温度和适当的食盐质量浓度可获得较高的总酸度。

图3 发酵温度与接种量对总酸度的影响Fig.3 Response surface and contour plots of total acidity (Y2) vs. fermentation temperature (X1) and inoculums size (X2)

图4 接种量与食盐质量浓度对总酸度的影响Fig.4 Response surface and contour plots of total acidity (Y2) vs. inoculums size (X2) and salt concentration (X3)

图5 发酵温度与食盐质量浓度对总酸度的影响Fig.5 Response surface and contour plots of total acidity (Y2) vs. fermentation temperature (X1) and salt concentration (X3)

2.2.6 优化发酵条件的验证

经3次验证，实验所得的总酸度平均值为0.51%，与预测值的总酸度0.52%接近，据报道[16]发酵菜的总酸度为0.5%～0.6%是适合人们的口感，表明本实验采用响应面优化的发酵条件可靠。

3 结 论

本实验以从泡菜老汤和泡菜卤中分离的乳酸菌，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)这3种菌不同比例组合的16种组合接种发酵甘蓝，从发酵制品亚硝酸盐含量、产酸量及风味因素，最终选肠膜明串珠菌、戊糖乳杆菌组合，接种质量比例为1:2和肠膜明串珠菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌组合，接种质量比例为1:1:1为优良发酵剂。

应用响应面分析法分析人工接种发酵甘蓝的条件，以总酸度建立数学模型，结合回归方程的方差分析，结果表明：以pH值为指标的回归方程对所有试验点拟合程度较差。说明总酸度回归方程对所有试验点拟合程度较好。所以以总酸度为测试指标验证发酵了条件。关于pH值拟合程度较差原因有待于进一步的研究。

应用响应面分析法优化了人工接种发酵甘蓝的条件，影响甘蓝发酵酸度的主要因素为食盐质量浓度，次要因素为发酵温度和接种量；发酵的适宜条件为食盐4g/100mL、接种量0.2%、发酵温度25℃。

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Optimization of Cabbage Fermentation Using Starter Culture

YAN Ping-mei，ZHAO Wen-jing，SONG Min-li，WU Li-hua，CHEN Yan-fei，ZHANG Teng
(Department of Biology, Taiyuan Normal University, Taiyuan 030031, China)

The purpose of this study was to develop a fermentation strater culture and to optimize the fermentation conditions for fermented cabbage production. In this study, 16 strains including single strains of Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pentosus and Leuconostoc mesenteroides isolated from Sichuan pickles and their combinations were first tested. Two different strain combinations were then selected out of them based on fermentation speed, nitrite content and fermented cabbage flavor for the optimization of fermentation by response surface methodology. The results showed that the optimal condition for cabbage fermentation by a mixture of Leuconostoc mesenteroides and Lactobacillus pentosus (1:2) or Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus pentosus, and Lactobacillus plantarum(1:1:1) were 4 g/100 mL salt, 0.2% of inoculum size and 25 ℃ of fermentation temperature. Main effect analysis showed that salt concentration had the greatest effect on total acidity of fermented cabbage, followed by fermentation temperature and then inoculums size.

inoculated fermentation；vegetables；lactic acid bacteria；response surface analysis

TS255

A

1002-6630(2012)11-0224-07

2011-10-13

国家自然科学基金面上项目(31171743)

燕平梅(1968—)，女，副教授，博士，研究方向为食品科学与食品微生物学。E-mail：yanpingmei@sohu.com