洋葱假单胞菌乳糖酸发酵条件的优化

郑 艳，匡立学，李 超，张玉龙*

(沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)

洋葱假单胞菌乳糖酸发酵条件的优化

郑 艳，匡立学，李 超，张玉龙*

(沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)

以选育的洋葱假单胞菌NTG-15-03为生产菌株，通过单因素和回归正交设计试验考察菌株种龄、接种量、发酵时间、发酵液初始pH值对乳糖酸产量的影响。结果表明：在pH7.0、种龄24h、接种量2%、发酵时间106h的条件下，该菌株的乳糖酸产量为10.08g/L。

乳糖酸；响应面分析；发酵

乳糖酸(lactobionic acid，LA)是由一分子半乳糖和一分子葡萄糖酸通过醚键连接起来的一种新型的多羟基有机酸[1]。它可以作为双歧因子、矿质元素吸收的促进剂、甜味剂、酸味剂、器官移植的保存剂等[2-3]，广泛的应用于食品加工、医药和精细化工领域。尽管乳糖酸具有多种生理功能，但在我国并没有实现商业化生产。目前在美国和欧洲，乳糖酸的生产主要是采用化学合成法[4]。由于该方法在氧化过程中常伴有多种副产物生成，因此生产成本相对较高。微生物发酵法生产乳糖酸的研究始于20世纪末，但尚未实现产业化。我国在此方面的研究尚属空白。

本实验以选育的洋葱假单胞菌(Burkholderia cepacia) NTG-15-03为出发菌株，通过单因素及回归正交设计试验对其发酵条件进行初步研究，以期为乳糖酸的发酵生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

洋葱假单胞菌由沈阳农业大学食品微生物实验室分离，编号为菌株NTG-15-03。

乳糖酸 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

Prominence LC-20A高效液相色谱系统 日本岛津公司；Anke TDL-40B精密离心机 上海安亭科学仪器厂；SHA-C水浴恒温振荡器 常州国华仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基的制备

斜面培养基：乳糖10g、蛋白胨5g、K2HPO41g、MgSO4·7H2O 0.1g、琼脂20g、蒸馏水1L，pH 7.2～7.4，121℃灭菌20min。

发酵培养基：乳糖10g、玉米浆10g、蛋白胨1g、NaCl 2g、K2HPO41g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O 0.5g，pH 7.2～7.4，121℃灭菌20min。

1.3.2 菌种的活化

将低温保藏的洋葱假单孢菌NTG-15-03接种至新配制的斜面培养基上，30℃恒温培养2d。将菌种反复活化3次后，置于冰箱中保藏。

1.3.3 乳糖酸的发酵

将活化好的种子培养液接种至含有100mL发酵培养基的三角瓶中，(30±1)℃恒温振荡培养96h。

1.3.4 乳糖酸含量的测定

采用HPLC法测定[6]，固定相：NH2P-50柱；检测器：RID-10A示差折光检测器；流动相：乙腈和40mmol/L Na2HPO4-20mmol/L柠檬酸缓冲液，pH 5.0，体积比6:4，在0.8mL/min、40℃条件下泵入。

1.3.5 回归正交试验设计

中心组合试验设计和结果分析方法：在Minitab 15软件中，按照Minitab→统计→DOE→响应曲面→创建响应曲面设计→中心复合的顺序，对以上4个因素进一步优化，进行四因素三水平的31组中心组合设计试验，设计试验的中心编码为0、0、0、0，试验的实际浓度选取单因素试验中乳糖酸产量最高的单因素数值，即种龄20h、接种量2%、pH7.0、培养时间96h。

按照确定的各因素编码水平和试验设计方法设计中心复合试验，各因素编码水平见表1。

表1 中心复合试验的编码及水平Table 1 Factors and levels of central composite design

2 结果与分析

2.1 菌株种龄对乳糖酸产量的影响

将种龄分别为12、16、20、24、28h的菌株种子以2%的接种量接种至pH7.2的发酵培养基中，4d后测定发酵液中乳糖酸的含量，结果见图1。

图1 菌株种龄对乳糖酸产量的影响Fig.1 Effect of seed age on the yield of lactobionic acid

由图1可知，随着种龄的增加，乳糖酸产量呈现出先升后降的趋势。以种龄为20h的种子接种，发酵液中乳糖酸含量最高。

2.2 接种量对乳糖酸产量的影响

图2 接种量对乳糖酸产量的影响Fig.2 Effect of inoculation amount on the yield of lactobionic acid

接种量的大小直接影响乳糖酸的发酵产量，合适的接种量不仅可以提高产物的合成速率，也有利于减少染菌机会。以种龄为20h细胞作为种子，分别以1%、2%、3%、4%、5%的接种量接种至pH7.2的发酵培养基中，发酵4d，测定乳糖酸含量。由图2可知，接种量为2%时发酵液中乳糖酸的产量最高；随着接种量的增加乳糖酸的产量开始下降，这主要是由于过大的接种量使得菌体细胞的数量增殖过快，营养消耗过多，进而影响到代谢产物的生成量。

2.3 pH值对乳糖酸产量的影响

图3 发酵液初始pH值对乳糖酸产量的影响Fig.3 Effect of initial fermentation pH on the yield of lactobionic acid

不同的发酵初始pH值不仅可以影响营养物质的可给性，同时也会影响代谢过程中酶的催化活性，进而影响到乳糖酸的产量。实验以种龄为20h细胞作为种子，以2%的接种量接种至不同pH值的发酵培养基中，发酵4d，测定乳糖酸产量。由图3可知，在发酵液初始pH值为7.0时，乳糖酸产量最高，因此确定该菌株的发酵初始pH值为7.0。

2.4 发酵时间对乳糖酸产量的影响

图4 发酵时间对乳糖酸产量的影响Fig.4 Effect of fermentation time on the yield of lactobionic acid

根据以上试验对种龄、接种量、pH值分别选择最优值，其他条件保持不变，分别发酵4 8、7 2、9 6、120、144h考察发酵时间对乳糖酸产量的影响。由图4可知，随着时间的延长，乳糖酸产量增加，自96h以后，随时间的延长，乳糖酸产量基本保持不变。

2.5 回归正交试验

2.5.1 中心复合试验结果

表2 中心复合试验结果Table 2 Central composite design matrix and results

利用Design Expert软件对表2实验数据进行二次多项回归拟合，获得乳糖酸产量对pH值、种龄、接种量、发酵时间的二次多项回归方程：

对二次多项回归方程进行显著性验证和方差分析，结果见表3、4。

表3 二次模型中回归系数的显著性检验Table 3 Significance test of each regression coefficient in the established quadratic regression model

由表3可知，因素X3、X4、X32对乳糖酸产量的曲面效应影响极显著，X2X4对乳糖酸产量的曲面效应影响显著，其他对乳糖酸产量的影响不显著。说明四因素均不同程度的对响应值产生显著或极显著的影响，原回归方程可化简为：

表4 中心复合试验结果进行拟合的二次模型方差分析Table 4 Variance analysis for the yield of lactobionic acid under various fermentation conditions

由表4可知，模型回归效果极显著，多元相关系数为R2＝0.9574，说明该模型对实验实际情况拟合较好，可用来进行响应值的预测，试验设计方案正确。

2.5.2 回归模型实验验证

经过实验设计和结果分析得到优化培养条件：菌株种龄24h、接种量2%、发酵时间106h、pH7.0。在此培养条件下洋葱假单胞菌发酵生产乳糖酸，得到的乳糖酸产量为10.08g/L，与模型预测值10.20g/L之间的误差小于5%。

3 结 论

本实验研究了发酵液初始pH值、接种量、种龄、发酵时间对洋葱假单胞菌NTG-15-03菌株发酵生产乳糖酸产量的影响。单因素试验和回归正交设计试验结果表明：在pH 7.0、种龄24h、接种量2%、发酵时间106h的条件下乳糖酸的产量为10.08g/L。

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Optimization of Fermentation Conditions for Lactobionic acid Production by Burkholderia cepacia

ZHENG Yan，KUANG Li-xue，LI Chao，ZHANG Yu-long*
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

The fermentation conditions of Burkholderia cepacia NTG-15-03 for the production of lactobionic acid were optimized using one-factor-at-a-time method and response surface analysis based on quadratic regression orthogonal design. The optimal fermentation conditions for the production of lactobionic acid were fermentation pH of 7.0, seed age of 24 h, inoculation amount of 2% and fermentation time of 106 h. Under these conditions, the yield of lactobionic acid was up to 10.08 g/L.

lactobionic acid；response surface analysis；fermentation

Q815

A

1002-6630(2012)11-0181-04

2011-05-15

郑艳(1973—)，女，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：zhengyan0403@163.com

*通信作者：张玉龙(1955—)，男，教授，博士，研究方向为农业资源利用。E-mail：ylzsau@163.com