毛霉发酵法制备豆渣可溶性膳食纤维的研究

潘进权，伍惠敏，陈雨钿

毛霉发酵法制备豆渣可溶性膳食纤维的研究

潘进权，伍惠敏，陈雨钿

(湛江师范学院生命科学与技术学院，广东 湛江 524048)

以豆渣为原料，采用毛霉发酵方法制备可溶性膳食纤维。采用单因素试验、部分析因设计、中心组合设计及响应面分析的方法对影响豆渣可溶性膳食纤维制备工艺的因素:培养基含水量、起始pH值、发酵温度、发酵时间等发酵工艺进行分析，并对其进行优化，确定相对较合适的发酵工艺条件:每支250mL三角瓶装干豆渣10g，加水调节其含水量为56.7%，添加蛋白胨2.33%、KH2PO4 0.57%、CaCl2 0.2%、吐温-80 0.2%，调节培养基起始pH6.0，接种后置于25℃发酵80h。在优化的工艺条件下，豆渣可溶性膳食纤维的得率可达42.2%。结果表明，毛霉发酵可以显著提高豆渣中可溶性膳食纤维的含量，应用该方法制备豆渣可溶性膳食纤维具有可行性。

可溶性膳食纤维；豆渣；毛霉；发酵；制备

广义上的膳食纤维泛指不能被人体内源酶消化吸收的可食用植物细胞、多糖、木质素以及相关物质的总和，包括食品中的大量组成成分如纤维素、半纤维素、木质素、胶质、改性纤维素、黏质、寡糖、果胶以及少量组成成分如蜡质、软木质。按其溶解特性不同分为可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber，SDF)和不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber，IDF)两大类，两者在人体内所具有的生理功能有所不同[1-3]。相比而言，可溶性膳食纤维对人体的生理代谢发挥着更为重要的作用，它具有防止胆结石、排除体内有害金属离子、防治糖尿病、降低血清及胆固醇、防止高血压和心脏病等作用[4-6]；是一种极具应用开发潜力的功能食品添加剂。

豆渣是大豆产品如豆奶或豆腐加工过程中的副产品，中国、阿根廷、巴西、美国、日本等国家每年豆渣的产量很大。因此豆渣的综合利用已成为各国科研工作者关注的重要问题之一。然而目前豆渣的利用率却很低，生产上主要是将豆渣作为动物饲料、焚烧或是直接废弃。这样不但造成了资源浪费也导致了环境污染。

研究显示，豆渣富含膳食纤维，其含量可高达60%以上，其中的大豆可溶性膳食纤维更是一种具有潜在应用价值的生理活性物质，具有明显降低血清胆固醇，改善血糖生成反应，改善大肠功能等作用，对机体健康有重要的生理功能[7]。因此，豆渣是制备可溶性膳食纤维的优良原料。虽然豆渣总膳食纤维含量较高，但是其中的可溶性膳食纤维的含量却非常低(小于5%)。因此，如何提高豆渣中可溶性膳食纤维的含量成为研究的关键。

毛霉是传统豆类发酵食品的常用菌种，它具有分泌多种水解酶，如蛋白酶、糖苷酶、纤维素酶、脂肪酶等的能力，可以实现豆渣中多种大分子物质的水解与转化[8-9]。为此，本研究拟以毛霉发酵的方法来转化豆渣，以提高豆渣中可溶性膳食纤维含量为目标对发酵工艺进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜干豆渣(含水量9.7%) 市售。

1.2 菌种与培养基

毛霉(Mucor sp.)，为湛江师范学院生命科学与技术学院发酵工程实验室分离保藏菌种。

试管斜面培养基:采用PDA培养基；菌种活化培养基:每支250mL三角瓶中加入干麸皮10g，水10mL，搅拌均匀，121℃灭菌20min，冷却后备用。

豆渣基础发酵培养基:每支250mL三角瓶中装入干豆渣10g，加入15mL水，搅拌均匀灭菌后备用。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

从试管斜面培养基上挑取一环毛霉孢子转接到菌种活化培养基上，混匀后置于恒温箱内，28℃培养3d。

1.3.2 孢子悬液制备

向活化后的三角瓶麸曲中加入无菌水100mL，充分摇匀，用4层无菌纱布过滤，其滤液即为毛霉孢子悬液(孢子浓度为107个/mL)，用作接种豆渣发酵用。

1.3.3 豆渣发酵实验

每支灭菌后的三角瓶发酵培养基中接入1mL孢子悬浮液，旋转摇匀，置于生化培养箱中28℃培养3d。

1.3.4 豆渣中可溶性膳食纤维的提取

在预实验[10-11]结果基础上，确定了发酵豆渣中可溶性膳食纤维的提取方法:豆渣发酵结束后，向每支三角瓶中加入蒸馏水300mL(相对于培养基原干豆渣，固液比1:30)，调pH值到4.0，在80℃恒温水浴锅中加热120min，抽滤得到滤液。加入4倍滤液体积的无水乙醇，静置30min，抽滤，并多次用80%乙醇洗涤滤渣。将滤渣置于烘箱中105℃烘干至恒质量并称质量。

1.3.5 SDF得率的计算

式中:m为发酵豆渣提取得到的SDF质量/g；m1为发酵培养基中原干豆渣的质量/g。

1.3.6 单因素试验

分别考察基础发酵培养基中各种营养添加物、含水量、起始pH值、发酵温度与时间对毛霉发酵及水溶性膳食纤维转化率的影响。

1.3.7 部分析因设计

通过上述单因素试验初步确定对毛霉发酵有促进作用的若干影响因素，并确定各因素的适宜取值范围。为了进一步考察这些因素的影响程度及各自合适的取值，利用Minitab软件，采用其中的Plackett-Burman设计，对上述单因素试验筛选到的因素做进一步的分析，并由此筛选出对毛霉发酵有显著促进作用的因素。

1.3.8 中心组合试验设计

利用SAS统计软件，采用响应面分析法中的中心组合设计[12]，对部分析因设计中筛选的因素做进一步考察，以确定其最合适的取值，并由此确定发酵工艺条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 营养添加物对毛霉发酵的影响

分别在豆渣基础发酵培养基中以干豆渣为基准添加质量分数3%的碳源(葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米粉)、2%的氮源(蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、NaNO3、(NH4)2SO4)、0.3%无机盐(MgCl2、CaCl2、ZnSO4、FeSO4、MnSO4、CuSO4)、0.5%无机盐(KH2PO4、K2HPO4)及0.2% 吐温-80，其他成分保持不变，进行固体发酵，从而筛选对毛霉发酵有促进作用的营养因素，结果如表1所示。可以看出，原基础发酵培养基中的碳源(残留于豆渣中的碳水化合物)已足以满足毛霉生长及代谢的需求，额外添加碳源对毛霉发酵并无显著促进作用，相反一些小分子碳源添加物对毛霉发酵表现出了显著抑制作用，降低了SDF的得率。这可能是由于这些小分子碳源的添加抑制了毛霉纤维素酶的诱导表达[13]；不同类型的氮源添加物对毛霉发酵的作用有明显差异，其中无机氮源对毛霉发酵几乎没有什么作用，而有机氮源尤其是蛋白胨可以显著促进毛霉发酵，提高SDF得率；在试验的几种无机盐中，仅有CaCl2与KH2PO4对毛霉发酵有较显著的促进作用；此外，培养基中添加一定量的吐温-80也对毛霉发酵及SDF得率有明显的促进作用。根据以上实验结果初步确定对毛霉发酵及S D F得率有促进作用的几种营养物:蛋白胨、CaCl2、KH2PO4及吐温－80。

2.1.2 培养基含水量对毛霉发酵的影响

对于固体发酵来说，培养基的含水量尤为重要，因为它直接关系着培养基中营养物质的溶解及运输，同时也与培养基中氧气的供应密切相关。培养基含水量过低，则营养物质及氧气的溶解及运输受到限制；过高的含水量又会导致培养基中空气流通受影响，从而使氧气的供给受到限制[14-15]。为了确定发酵培养基的合适含水量，采用原发酵培养基分别于不同含水量(35%～80%)的条件进行固体发酵实验，考察培养基含水量对毛霉发酵的影响，结果如图1所示。培养基含水量对毛霉发酵有显著的影响，当培养基的含水量低于50%或是高于75%时，豆渣SDF得率明显偏低。故确定发酵培养基合适的含水量在50%～70%的范围。

图1 培养基含水量对毛霉发酵的影响Fig.1 Effect of water content in the medium on SDF yield

表1 各种营养添加物对毛霉发酵的影响Table 1 Effects of nutrient supplements on SDF yield

2.1.3 培养基起始pH值对毛霉发酵的影响

图2 pH值对毛霉发酵的影响Fig.2 Effect of pH on SDF yield

在总含水量不变的前提下，分别用酸或碱调节原基础发酵培养基的起始pH值至4.0～9.0的范围，然后进行发酵试验，考察培养基起始pH值对毛霉发酵的影响。由图2可知，pH值对毛霉发酵及豆渣中膳食纤维转化有较显著的影响，培养基的酸性或碱性太强均不利于菌体生长及膳食纤维的转化；相比而言，弱酸性的条件更有利于该菌种发酵。确定发酵培养基适宜的起始pH值在5～7的范围。

2.1.4 发酵温度对毛霉发酵的影响

采用基础培养基分别于不同温度(18、22、25、28、31、35、38℃)条件下进行发酵实验，考察温度对毛霉发酵的影响，结果如图3所示。毛霉菌是一种适低温菌，相对较低的温度(低于28℃)有利于该菌体生长及膳食纤维的转化，过高的温度对毛霉发酵不利。如，当发酵温度高于31℃时，毛霉的生长及膳食纤维的转化将受到显著的抑制。根据实验结果初步确定该菌种合适的发酵温度在22～28℃范围。

图3 温度对毛霉发酵的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on SDF yield

2.1.5 发酵时间对毛霉发酵的影响

图4 发酵时间与SDF得率的关系Fig.4 Effect of fermentation time on SDF yield

采用原基础发酵培养基进行固体发酵实验，分别于不同时间取样测定SDF得率，考察发酵时间对毛霉发酵的影响，结果如图4所示。在发酵的前期(24h内)，由于孢子刚刚萌发，菌丝初步形成，菌体量少，酶活力低，因此膳食纤维的转化速率非常低；发酵30h后，菌体进入快速生长及产酶旺期，膳食纤维的转化基本上以恒速进行；发酵到72h后，由于培养基水分的大量蒸发、营养物质的消耗以及培养基pH值的变化等在很大程度上抑制了菌体的生长，膳食纤维的转化速度趋于平缓，SDF得率逐渐达到最大。初步确定毛霉发酵的合适时间为70～90h。

2.2 部分析因设计

通过以上单因素试验筛选得到对毛霉发酵有促进作用的8个因素。为了进一步分析这些因素对毛霉发酵影响的显著性，采用部分析因设计的方法对其进行了进一步考察，表2～4分别给出了试验设计的因素水平设计、结果及其回归分析。

表2 部分析因设计的因素水平表Table 2 Factors and levels of fractional factorial design

表3 部分析因试验设计及结果Table 3 Fractional factorial design scheme and corresponding experimental results

由表4可知，在表2设定的各因素取值范围内，因素A、C、E、F对毛霉发酵表现为正效应，即对毛霉发酵与SDF得率有促进作用；因素B、D、G、H在取值范围内对毛霉发酵表现出负效应；在考察的8个因素中，蛋白胨(A)、KH2PO4(C)、培养基含水量(G)对毛霉发酵的影响极为显著(P＜0.01)；CaCl2(B)、吐温-80(D)及发酵温度(E)对毛霉发酵的影响较显著(P＜0.05)；发酵时间(F)与培养基起始pH值(H)对毛霉发酵的影响不显著(P＞0.05)。另外，本试验结果的曲率分析则表明，部分析因设计确定的实验空间是一极显著的曲面(P＜0.01)，其中必然存在最大或最小响应点。为了确定此实验空间内的极值响应点，后续实验将以因素A、C、G为对象，在表1所示的各因素取值范围内进行中心组合试验设计及响应曲面分析。在此同时固定因素B、D、E和F的取值为中水平。

表4 部分析因试验结果的回归分析Table 4 Regression analysis of the experimental results of fractional factorial design

2.3 中心组合试验设计结果

在以上部分析因试验结果的基础上进行了中心组合试验设计，考察了蛋白胨(A)、KH2PO4(C)和培养基含水量(G)三者的相互作用及其对毛霉发酵的影响。中心组合试验设计及结果如表5所示。

表5 中心组合试验设计及结果Table 5 Central composite design scheme and corresponding experimental results

对表5的试验结果进行回归分析，可以拟合得到以下数学模型:

分析表明，该回归模型具有非常高的显著性，其P＝0.000＜0.01，R2＝0.9250，说明该模型可以拟合实验空间中92.5%的实验结果。图5～7给出了拟合模型的响应曲面。可以看出，该曲面是一典型的凸面响应，其上存在最大响应点。利用SAS软件分析确定了最大响应值为(42.3±0.6)%，其对应的因素取值分别为蛋白胨2.33%、KH2PO40.57%、培养基含水量56.7%。在此条件下，测得SDF得率平均值为42.2%，与模型的预测值基本一致，进一步验证了该模型的可靠性。

图5 蛋白胨与KH2PO4对毛霉发酵的影响Fig.5 Response surface plot showing the effects of peptone and KH2PO4 on SDF yield

图6 KH2PO4与培养基含水量对毛霉发酵的影响Fig.6 Response surface plot showing the effects of KH2PO4 and water content in the medium on SDF yield

图7 蛋白胨与培养基含水量对毛霉发酵的影响Fig.7 Response surface plot showing the effects of petone and water content in the medium on SDF yield

根据以上优化实验的结果，由此可确定毛霉发酵制备可溶性膳食纤维的工艺条件为:每支250mL三角瓶装豆渣10g，加水调节其含水量为56.7%，添加蛋白胨2.33%、KH2PO40.57%、CaCl20.2%、吐温-80 0.2%，调节培养基起始pH值为6.0，灭菌后接种1mL孢子悬浮液，置于25℃发酵80h。

3 讨 论

豆渣是大豆制品加工后的废弃物，开展其应用相关研究对于提高资源利用率，改善豆渣废弃导致的环境问题有重要意义。以豆渣为原料提取制备可溶性膳食纤维是该领域的研究热点。在众多以往的研究报道中，豆渣膳食纤维的转化采用较多的是物理方法，如蒸煮、挤压或辅助超声波作用[16-17]，虽然这些方法对豆渣中可溶性膳食纤维含量的提高有一定的作用，但由于工艺复杂、生产成本较高而不具有推广价值。近年来也有采用酶解的方法制备豆渣膳食纤维的报道[18-19]，虽然生产工艺较温和，能耗也较低，但由于单一酶解的效率并不高，因此豆渣可溶性膳食纤维的转化率也是比较低的。

为了克服酶解法的不足，本研究提出了以毛霉发酵的方法转化豆渣制备可溶性膳食纤维，利用毛霉发酵过程中分泌的复合酶系水解豆渣中大分子物质，从而极大程度上提高豆渣可溶性膳食纤维的得率。该研究采用单因素试验、部分析因设计及响应面分析的方法对影响毛霉发酵的若干因素进行了分析，并对发酵工艺进行优化，确定了合适的发酵工艺条件。在优化的条件下，豆渣可溶性膳食纤维的得率可以达到42.2%，高于现有文献报道结果[16-20]。结果表明:毛霉发酵可以显著增加豆渣中可溶性膳食纤维的含量，提高可溶性膳食纤维的得率；应用该工艺制备豆渣可溶性膳食纤维具有较好的可行性。

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Preparation of Soluble Dietary Fiber from Soybean Dregs by Mucor Fermentation

PAN Jin-quan，WU Hui-min，CHEN Yu-tian
(School of Life Science and Technology, Zhanjiang Normal University, Zhanjiang 524048, China)

Soybean dregs were used as the basal fermentation medium for Mucor to produce soluble dietary fiber (SDF). The effects of major parameters including water content in medium, initial pH, fermentation temperature and fermentation time were analyzed and the fermentation process was optimized by one-factor-at-a-time design (OFAT), fractional factorial design (FFD), central composite design (CCD) and response surface methodology. The optimal fermentation process conditions were 10 g of soybean dregs contained in a 250 mL shake flask with the addition of 2.33% peptone (g/g soybean dregs), 0.57% KH2PO4, 0.2% CaCl2 and 0.2% Tween-80 as the nutrient supplements, initial water content of 56.7%, fermentation temperature of 25 ℃ and fermentation time of 80 h. Under these conditions, the yield of SDF could reach up to 42.2%. Therefore, Mucor fermentation is applicable for the preparation of SDF from soybean dregs.

soluble dietary fiber；soybean dregs；Mucor；fermentation；preparation

TS209

A

1002-6630(2012)15-0210-06

2011-06-23

广东省自然科学基金项目(9452404801001943)；湛江师范学院基金项目(ZL0912)

潘进权(1978—)，男，讲师，博士，研究方向为酶与发酵工程。E-mail:pjq78@tom.com