用HPLC柱后衍生法分析烟草中氨基甲酸酯类农药残留

邵金良，汪禄祥，刘宏程，兰珊珊，梅文泉，邹艳虹，杨 芳

（云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，昆明 650223）

氨基甲酸酯类农药是以甲酸酯为前体化合物发展而来的农药，具有分解快、残留期短、低毒、高效、选择性强等特点，是继有机磷之后在烟草种植过程中使用较为广泛的杀虫剂和除草剂[1]。农药在保护烟草产品质量的同时，其在烟草中的残留也会对人体造成不同程度的伤害[2]。大多数氨基甲酸酯类农药施用后在很短的时间内就可被降解，降解产物的活性通常与母体化合物相当或更强，毒性甚至更大。例如涕灭威降解后生成的涕灭威亚砜、涕灭威砜的毒性比涕灭威强。因此，在检测氨基甲酸酯类农药残留时，必须同时检测代谢产物[3]。

目前，关于氨基甲酸酯类农药残留量的分析国内外均有报道，检测方法主要有气相色谱法（GC）[4]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[5]、高效液相色谱法（LC）[6]、高效液相色谱-质谱法（LC-MS）[7]等。这些方法各有优缺点，由于氨基甲酸酯类化合物极性强，热稳定性较差，使用GC或GC-MS检测时常采用特殊的技术或手段以达到准确测定的目的，方法复杂[8]。而用HPLC进行分析，氨基甲酸酯类化合物的紫外吸收较弱，直接检测灵敏度较低[1]。用高效液相色谱柱后衍生系统、荧光检测器检测烟草中氨基甲酸酯类农药时，背景中几乎不含有带-CONH-基团的物质干扰，很难衍生成具有荧光的物质，因此，具有杂质干扰小，检测稳定，灵敏度高、重现性好等优点[9]。本试验并优化了烟草中涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、三羟基克百威、涕灭威、克百威、甲萘威、异丙威等8种农药的样品前处理方法和高效液相色谱分离检测条件，对烟草中8种氨基甲酸酯类农药残留高效液相色谱（带荧光检测器和柱后衍生系统）多残留检测方法进行了研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 高效液相色谱仪-荧光检测器（PerkinElmer 200A）、色谱柱 Waters Symmetry Shield™（C18，5 μm，4.6×250 mm）、回旋式震荡器（HY-5）、旋转蒸发仪（RE-52AA）、SPE净化柱（Florisil-SPE 1 g/6mL；LC-NH2–SPE 500 mg/3mL；C181 g/6mL）、氮吹仪（Organomation Associates）、超纯水机（Arium 611）。

1.1.2 试剂 乙腈（AR）、二氯甲烷（AR）、乙腈（HPLC）、甲醇（HPLC）、NaOH溶液、OPA稀释溶液、邻苯二甲醛、巯基乙醇、涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、三羟基克百威、涕灭威、克百威、甲萘威、异丙威等8种农药标准品（1000.0 mg/L农业部环境保护科研监测所生产）。

1.2 样品的处理与分析

1.2.1 样品处理 称取5.0 g烟叶样品于250 mL磨口三角瓶中，加入100 mL乙腈:水（1:1，V/V）按文献[10]步骤进行提取。用 2 mL甲醇:二氯甲烷（1:99，V/V）溶解样品，待净化。净化用NH2-SPE柱。5 mL二氯甲烷:甲醇（1:99，V/V）预淋洗，弃去淋出液，将上述2 mL二氯甲烷:甲醇溶液转入柱中，用6 mL甲醇:二氯甲烷（1:99，V/V）淋洗SPE柱，收集淋出液，40 ℃氮吹浓缩至近干，用2 mL甲醇定容，经0.22 µm有机相滤膜过滤，待测定。

1.2.2 色谱条件 流动相：乙腈/水(0～8 min，25:75，V/V；8～25 min，45:55，V/V；25～28 min，25:75，V/V) ；流速1.0 mL/min；测定波长Ex=339 nm，Em=445 nm；柱温30.0 ℃；进样量：10.0 µL；柱后衍生条件：0.05 mol/L NaOH 溶液，流速0.30 mL/min；OPA试剂，流速0.30 mL/min；衍生温度80 ℃。

1.2.3 保留时间 涕灭威亚砜 4.28～4.34 min，涕灭威砜5.55～5.70 min，灭多威6.42～6.55 min，三羟基克百威 9.01～9.21 min，涕灭威 15.24～15.45 min，克百威 18.50～18.81 min，甲萘威 20.03～20.50 min，异丙威22.85～23.34 min。

2 结果与讨论

2.1 线性关系和检出限

取一定量的氨基甲酸酯混标准母液，稀释成浓度分别为0.02，0.2，1.0，5.0，10.0 mg/kg的氨基甲酸酯标准曲线工作液，按上述方法提取，净化和测定，绘制标准曲线[11]。8种氨基甲酸酯农药的线性范围、回归方程、相关系数及检出限见表 1，相关图谱见图1～3。

2.2 添加回收率与相对标准偏差

以干烟叶为对照样品，分别添加3个不同浓度的8种氨基甲酸酯农药标准品溶液，每个样品重复5次，按上述方法提取、净化和检测。表2可见，样品加标浓度为 0.05 mg/kg时，平均回收率为80.8%～110.6%，相对标准偏差为 3.2%～10.8%；0.1 mg/kg时，平均回收率为84.4%～109.7%，相对标准偏差为3.8%～11.8%；0.5 mg/kg时，平均回收率为 81.6%～112.9%，相对标准偏差为 3.7%～8.5%。

图1 烟叶对照色谱图Fig.1 Chromatogram of tobacco blank

图2 烟叶加标色谱图（0.1 mg/kg）Fig.2 Chromatograms of tobacco sample spiked at 0.1 mg/kg of each pesticide

图3 8种氨基甲酸酯色谱图（0.1 mg/L）Fig.3 Chromatogram of 8 carbamate pesticides

表1 8种氨基甲酸酯类农药残留的回归方程、相关系数Table1 Linearity and limits of detection of the 8 carbamate pesticides

2.3 最佳操作条件的选择

2.3.1 提取溶剂的选择 在氨基甲酸酯类农药残留分析中常用的提取溶剂有乙腈、丙酮、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、甲醇等[12]。分别选择甲醇:水（1:1，V/V）、乙腈:水（1:1，V/V）、丙酮:水（1:1，V/V）、乙酸乙酯:水（1:1，V/V）作为提取溶剂，相同试验条件下，加标浓度为0.1 mg/kg。试验结果表明（图4），使用丙酮:水（1:1，V/V）的平均回收率为 61.8%，乙酸乙酯:水（1:1，V/V）为67.5%，其回收率明显低于甲醇:水（1:1，V/V）的81.3%和乙腈:水（1:1，V/V）的 94.1%。而用乙腈:水（1:1，V/V）提取的样品基质干扰较小，考虑到综合提取效率、选择性、溶剂化作用和渗透能力等因素，本方法采用乙腈:水（1:1，V/V）作为提取溶剂。以1:1比例的乙腈/水提取后再以 10%氯化钠溶液和二氯甲烷萃取，能更好的避免将色素、焦油及水溶性杂质提取出来，使提取液更洁净，无较大干扰峰[13]。

2.3.2 固相萃取柱的选择 烟草是含有大量脂肪、色素、多糖等大分子组分的复杂基质[13]。对于极性较大的氨基甲酸酯类农药残留的分析，采用液-液分配法净化后，回收率往往很低，有一定的局限性，目前多采用固相萃取技术进行净化，具有操作步骤少，溶剂用量少等优点。本文考察氟罗里硅柱、C18柱、氨基固相萃取柱的净化效果。在烟叶中添加已知量的氨基甲酸酯农药标准品，8种氨基甲酸酯农药经氟罗里硅土柱净化，回收率只有65.0%，而经C18和氨基固相萃取柱净化，回收率有95.0%。实际样品测定时，C18固相萃取柱净化，存在部分干扰；氨基固相萃取柱能有效地吸附有机酸和糖分，回收率高且没有干扰。

表2 烟草氨基甲酸酯类农药加标回收率和重复性试验结果（n=5）Table2 Recoveries and coefficient variations of 8 carbamate pesticides

2.3.3 洗脱液配比和洗脱体积的选择 氨基固相萃取柱经活化后，取 8种农药的混合标样（0.25 mg/L）1 mL上样，平行3份，分别用甲醇:二氯甲烷（1:99，V/V），甲醇:二氯甲烷（3:97，V/V），甲醇：二氯甲烷（5:95，V/V）及甲醇:二氯甲烷（7:93，V/V）等4种溶液洗脱。甲醇体积分数为1%～7%时，8种氨基甲酸酯的回收率基本稳定，随着甲醇用量增加杂质峰也明显增多，因此选择甲醇:二氯甲烷（1:99，V/V）作为洗脱溶液。在优选洗脱剂配比的基础上，进一步筛选洗脱剂用量对回收率的影响，结果表明，前4 mL洗脱液对回收率的影响最大，当洗脱液体积达到8 mL时，继续增大洗脱液用量，对8种氨基甲酸酯的回收率没有影响。

2.3.4 流动相的选择 为了获得最佳分离效果，分别考察了乙腈、水及甲醇、水溶液作流动相时的分离情况；分别考察等度和梯度洗脱条件对分离效果的影响。结果发现，甲醇+水，乙腈+水可以实现氨基甲酸酯类农药的有效分离，当乙腈+水体系作为流动相时，待测物氨基甲酸酯类农药的响应信号较强，分离效果更好。而甲醇+水体系流动相的极性杂质较多，个别峰形不理想，干扰较大，响应信号较低，故选择乙腈+水体系作为流动相。

淋洗条件试验结果表明，乙腈相配比越大，出峰越快，峰形越好，但分离度较差；水相配比加大，分离度提高，但峰型宽，分析时间长。当乙腈体积分数从25%线性递增至45%并保持不变时，随着洗脱能力增强，涕灭威、克百威、甲萘威和异丙威依次流出，峰面积信号也最强，且前者的峰形更对称。为了使8种氨基甲酸酯类农药既能在尽量短的时间内完全分离，又能得到峰型较好的色谱峰，经实验确定最佳梯度洗脱条件见表 3。采用该色谱条件可使8种氨基甲酸酯类农药完全分离并能大大缩短分析时间。

2.4 实际样品分析

应用建立的高效液相色谱-柱后衍生荧光分析方法，测定了12个烟草样品中8种氨基甲酸酯类农药的残留量，均未检出氨基甲酸酯类农药残留。

表3 8种氨基甲酸酯类农药梯度洗脱条件Table3 Gradient elution conditions of 8 carbamate pesticides

3 结 论

本研究建立了一种快速测定烟草中氨基甲酸酯类农药残留的高效液相色谱-柱后衍生荧光定量方法，在25 min内可同时完成烟草中涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、三羟基克百威、涕灭威、克百威、甲萘威、异丙威等8种氨基甲酸酯农药的分析测定。本方法具有多种农残同时提取、净化，准确度高、重现性好等优点，可用于烟草中多种氨基甲酸酯类农药残留的分析。

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