动物性食品中土霉素、金霉素和四环素检测方法研究进展

杨 琳

（万源市动物疫病预防控制中心，四川 万源 636350）

四环素类药物（TCs）具有广谱抗生活性，有良好的杀菌抑菌作用，不仅对革兰氏阳性，革兰氏阴性和支原体，甚至对立克次体和衣原体之类的微生物都有活性[1]。价格便宜，经常作为饲料添加剂用于畜牧及水产养殖中，常见的TCs包括四环素（Tetracycline，TC）、土霉素（Oytetracycline，OTC）、金霉素（chlortetracycline，CTC）和强力霉素（Doxycycline，DC）[2]。近年来，为有效预防和治疗畜禽、鱼类的疾病，兽药及化学药品被广泛地应用做饲料添加剂，以促进其生长速度，控制其生殖周期和繁育能力。土霉素、金霉素和四环素是我国应用最广、应用时间最长的动物保健性抗生素，一些不法分子为了经济效益，常滥用这类药物，致使在动物性食品中大量残留，不仅危害人体健康，而且更为严重的是畜禽产品中残留较低浓度的土霉素、金霉素和四环素容易诱导各种致病菌产生耐药性，不利于对人类和畜禽类疾病的治疗[3-5]。世界粮农组织、世界卫生组织、欧盟及我国等都对畜禽产品中土霉素、金霉素和四环素的残留做出了严格的规定。因此，控制土霉素、金霉素和四环素的使用，实施对畜禽产品中土霉素、金霉素和四环素及有害代谢产物残留的检测分析十分重要。本文就目前畜禽产品中土霉素、金霉素和四环素的残留分析方法的新进展进行综述。

1 土霉素、金霉素和四环素的危害

土霉素、金霉素和四环素都属于四环素类抗生素，常用于防止禽畜病害，促进幼年禽畜生长等。随着TCs在畜禽养殖中的广泛应用，滥用药的情况时有发生，其残留问题也引起了人们的高度关注。长期食用含有抗生素的食品将对人们的健康造成极大危害，引起骨骼畸形和生长抑制，干扰人体的正常生理机能，影响儿童和青少年的生长发育，降低人体对致病菌的抵抗能力，并可造成肝肾损害，引起前庭反应、过敏反应、变态反应、耐药性等[6]。

2 土霉素、金霉素和四环素的限量标准

随着人们生活水平的提高，食品安全问题日益受到广泛关注，兽药残留问题也引起高度重视。土霉素、金霉素和四环素在畜禽及水产养殖中应用广泛，在畜牧产业发展中发挥了重大作用，但是一些不法分子滥用四环素类抗生素，造成其在畜禽产品中大量残留，因此，一些国家和地区纷纷建立了土霉素、金霉素和四环素的限量标准（表1）。

表1 部分国家和地区限量标准

3 土霉素、金霉素和四环素检测方法

3.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。HPLC是目前常用于兽药残留检测的方法，可进行定性和定量分析，并可配套使用不同的萃取、提纯及柱前、后衍生和灵敏的检测系统，主要有紫外检测器、荧光检测器、示差检测器、质谱检测器以及安培计。李月欢等[7]建立超高效液相色谱—电喷雾串联四极杆质谱快速测定畜、禽肉中土霉素、四环素、金霉素的方法。土霉素、四环素、金霉素的最低检出限分别为0.1、0.1、0.5 µg/kg，在5.0～80.0 ng/L的线性范围内，相关系数r均大于0.99，回收率82.6%～111%。智若岚等[8]建立了测定猪肉组织中土霉素及金霉素残留量HPLC法，土霉素、金霉素标准品分别在0.1～1.0 µg/mL、0.2～2.0 µg/mL范围内线性关系良好；土霉素在3个不同浓度添加水平的回收率为78.06%～87.21%，变异系数为3.02%～7.72%；金霉素的回收率为76.45%～85.62%，变异系数为3.46%～6.32%。土霉素及金霉素的最低检出线分别为20 µg/kg和10 µg/kg（表2）。

表2 高效液相色谱法检测土霉素、金霉素和四环素

HPLC用于真菌毒素检测结果准确可靠，灵敏度、分辨率高，重现性好，样品需要量少，溶剂用量少，能把同时分离多种物质，适用于四环素类兽药残留的精准检测；但由于其设备昂贵、对样品中样品纯度的要求较高、前处理复杂、建立方法比较困难，导致检测成本高、周期长，无法满足大批量样本快速筛查的需要，因而使用受到限制。

3.2 免疫学方法

免疫学分析法是以抗原抗体的免疫反应为基础进行抗原抗体含量测定的方法，它具有高度的特异性、灵敏性和快速简便等优点。用于土霉素、金霉素和四环素检测的免疫学方法主要有酶联免疫法（ELISA）和胶体金免疫层析技术。

邢淑婕等[22]采用间接竞争ELISA分析了自制抗土霉素抗体的灵敏度与特异性，结果表明，所得抗体的灵敏度和特异性都较好，与其它结构相似或相近物质的交叉反应率较低；同时对蜂蜜中土霉素的提取方法进行了研究，得出了最佳提取方法和条件；检测范围为5～200 ng/mL，相关系数r为0.9951，在此范围内对人工污染样品的平均回收率为97.5%～107.0%。刘智宏等[23]构建了一种四环素类药物残留酶联免疫检测试剂盒，试剂盒的最低检测限为0.3 µg/L，检测范围为0.3～30 µg/L，可同时测定兽医常用的四环素、金霉素、土霉素和多西环素4种药物残留，灵敏度、精密度和准确度均能满足兽药残留检测要求。邢淑婕等[24]以自制抗体建的间接竞争ELISA法对牛奶中土霉素的残留进行了检测，所建立的间接竞争ELISA方法对土霉素的检测范围为5～200 ng/mL，相关系数为0.9951。付云洁等[25]研究了食品中金霉素残留的胶体金免疫层析法的快速检测方法，试纸条法的金霉素检测限为0.7 µg/mL，检测时间仅需5 min。林杰等[26]探讨应用ROSA法同时快速检测UHT奶中的四环素类和β—内酰胺类药物残留，验证了ROSA法的检测灵敏度、特异性和稳定性，10 min可出检测结果。檀尊社等[27]建立用于快速检测水产样品中四环素类药物残留含量的胶体金免疫层析检测试剂，试剂灵敏度最低值可达100 ng/mL，仅需5～10 min，与金霉素、土霉素、强力霉素等四环索族抗生素有很强的交叉反应。武玉香等[28]研究了斑点金免疫渗滤法快速检测禽肉中金霉素残留，方法的检测限为0.4 µg/mL，在金霉素浓度为0.6～µg/mL范围内可实现定量分析。免疫学方法用于金霉素、土霉素和四环素检测，灵敏，简便，快速，特异性强，对样品中净化纯度要求不高，能同时对多个样品定性或定量检测，适于兽药残留的批量检测，但检测结果的重现性差，酶稳定性差，试剂寿命短，而且由于存在交叉反应而易造成假阳性，使复杂样品受干扰，因此需要用其它的方法来验证。适用于样品的定性筛选检测。

3.3 其他检测方法

少数研究表明毛细管电泳法、微生物学法也可用于土霉素、金霉素和四环素的检测。邢晓平[29]运用毛细管电泳—电化学检测法对鸡蛋中残留的四环素、土霉素进行快速测定分析。TC和OTC的线性范围分别为2.0×10-6～5.0×10-4g/mL、8.0×10-6～3.0×10-4g/mL，检出限分别为1.9×10-8g/mL、4.1×10-8g/mL。陈树桥等[30]建立了一种相对简便有效的微生物法检测青虾肌肉组织中土霉素的残留。在0.32～5.12 µg/mL的土霉素浓度范围，线形关系较好，相关系数达0.999。在青虾肌肉中的最低检出限是2.0 µg/kg，通过与HPLC对比并经t检验，发现2种方法检测结果没有显著性差异。毛细管电泳法检测四环素类药物残留不需要过柱等繁琐的预处理过程，方法简便、易操作。微生物学方法操作简便、具有一定的灵敏度，特别在大批量样品分析中具有很大优势[31]。

4 小结与展望

食品中兽药残留严重影响公共健康，兽药残留的检测引起了人们的高度重视。土霉素、金霉素和四环素作为常用的动物用药，其残留问题已较普遍，其检测方法已经建立。目前，在土霉素、金霉素和四环素的检测中，高效液相色谱法是应用最为广泛的检测方法，酶联免疫分析法和胶体金免疫分析法也发展很快，同时逐渐出现了毛细管电泳法和微生物学法等检测方法。这些检测方法各有优缺点，高效液相色谱法，尤其是HPLC—MS联用技术，具有高灵敏度、高分离效率和高准确度，但必须要有一定的测定仪器支持，前处理过程也较复杂，净化程度要求较高，检测成本较高，主要应用于土霉素、金霉素和四环素残留的定量测定。免疫学方法则具有简便、快速、灵敏的特点，但准确度则稍差，侧重于大批量样品的定性筛选检出。在今后的研究中，抗生素类药物替代品有很好的研究前景，像微生物制剂类生物药品既能代替抗生素的功能，在动物养殖业中发挥重大作用，又不至于导致细菌产生耐药性，对人类健康构成重大威胁。同时应致力于建立既简便、快速，又灵敏度高、重复性好、准确度高、检测成本低的检测方法，保证公共健康。

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