广西黑山羊羊种布鲁氏菌的分离和鉴定

李常挺，李 军，覃俊江，杨 威，陈泽祥，赵 武

（1.广西隆安县动物疫病预防控制中心，广西 隆安 532700；2.广西兽医研究所，广西 南宁 530001；3.广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西 南宁 530001；4.隆安县水产畜牧兽医局，广西 隆安 532700）

广西黑山羊是我国肉用山羊品种之一，具有被毛全黑、适应性强、肉质鲜嫩、营养丰富等优良特性。布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属细菌引起的人畜共患传染病，其主要特征是生殖器官和胎膜发炎，引起流产、不育[1]。广西自50年代发生布鲁氏菌病疫情以来主要以猪布鲁氏菌病为主，牛和羊基本无疫情[2-3]。2000年以后，由于规模化养殖步伐加快、家畜流动性大增，不少农户陆续从外省引进牛羊饲养，但是他们对《中华人民共和国动物防疫法》和《种畜禽管理条例》缺乏了解，没有申报就盲目私自从外省购买家畜，2002年牛种布鲁氏菌病疫情和2004年羊种布鲁氏菌病疫情就是通过无序引种的方式引入广西[4-5]。最近隆安县某黑山羊养殖户饲养的黑山羊多次出现流产和死胎，流产多发生于黑山羊怀孕后的3～4个月，近半年内整个羊群母羊流产达到60%。经现场调查和实验室检测，证实该群黑山羊感染羊种布鲁氏菌病。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 该羊群血清10份（公畜血清1份，母畜血清9份）；流产死胎2只。

1.1.2 主要试剂和仪器 布鲁氏菌液体培养基购自美国BD公司，胰蛋白示购自英国Oxiod公司，马血清购自美国Thermo公司，布鲁氏菌虎红凝集抗原和凝集试管抗原购自中国兽药监察所，细菌基因组DNA提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司。PCR Taq Mix、DNA Marker 2购自天根生化科技（北京）有限公司，PCR仪购自日本TaKaRa公司，凝胶成像系统购自美国Alpha Inotech公司。

1.2 方法

1.2.1 血清学检测 首先使用虎红平板凝集试验对黑山羊血清进行布鲁氏菌病阳性抗体的初筛，阳性血清再按照《布氏病试管凝集试验（GB/T18646）》进行确认[6]。

1.2.3 细菌分离 将流产胎儿先用无菌生理盐水清洗干净，然后放在3%的来苏儿水中浸泡30 min，取出在无菌条件下进行解剖，取淋巴结、肝、脾、肺、心血等病料分别接种5%马血清胰蛋白示培养基上，置5%二氧化碳培养箱中37 ℃培养7 d，观察培养基上细菌生长情况。

1.2.4 布鲁氏菌的PCR鉴定 应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养基上湿润、光滑、圆形、革兰氏染色为阴性小杆菌的细菌基因组DNA，按陈泽祥等建立的PCR检测方法对细菌进行布鲁氏菌的PCR鉴定[7]。使用AMOS-PCR方法进行布鲁氏菌种型的PCR鉴定[8]。以羊种布鲁氏菌5号疫苗为阳性对照。

2 结果

2.1 布鲁氏菌抗体检测 布鲁氏菌虎红平板凝集试验结果表明，所检10份黑山羊血清全部出现阳性反应。对这10份黑山羊血清进行布鲁氏菌试管凝集试验，结果有8份山羊血清（1头公羊和7头母羊）呈布鲁氏菌抗体阳性反应。

2.3 细菌分离培养 流产胎儿淋巴结、肝、脾、肺、心血接种的培养基在培养到48 h时，均看见有细菌生长，培养到72 h观察到白色、圆形突起、针尖大小的菌落。将菌落抹片、火焰固定，革兰氏染色显微镜观察细菌呈红色、单个排列、球状。在清洁无油脂的玻片上，一端滴一滴灭菌生理盐水，一端滴一滴从中国兽医监察所购买的布鲁氏杆菌病阳性血清，然后用接种环取少量菌落分别放入生理盐水和阳性血清内，轻轻研磨、混匀，观察凝集情况。结果生理盐水不凝集，阳性血清内有沙粒状的凝集反应。说明分离的细菌为光滑型布氏杆菌。

2.4 细菌的PCR鉴定 按陈泽祥等建立的PCR检测方法对细菌进行布鲁氏菌的PCR鉴定，PCR产物电泳出现布鲁氏菌193 bp的目的条带（图1），可确定该细菌为布鲁氏菌。

利用AMOS-PCR对分离的布鲁氏菌进行种型鉴定，PCR电泳结果显示在731 bp处出现目的条带（图2），将PCR产物送上海英骏生物技术有限公司测序，测序结果为羊种布鲁氏菌，可以确定分离布氏菌为羊种布氏杆菌。

2.5 疫情的处理 根据黑山羊的临床症状、血清学诊断和流产胎儿分离细菌鉴定结果，确定该病例为羊种布鲁氏菌病。结果确定后立即根据农业部《布鲁氏菌病防治技术规范》（农医发[2007]12号）启动疫情处理程序：县动物卫生监督所下文，立即进行全群扑杀，无害化处理；对羊栏、场地和污染物进行了严格消毒，并对同村饲养的山羊、种猪、牛进行监测，结果没有发现布鲁氏菌病病畜。

3 讨论

近年来广西山羊也曾检测出过布鲁氏菌血清抗体阳性羊，但没有分离出布氏菌。此次在广西黑山羊血清中检测到布氏菌抗体阳性，流产胎儿分离出羊种布鲁氏菌，说明广西山羊也面临着布鲁氏菌病的严重威胁。家畜饲养量剧增、种畜调运频繁、流通环节检疫监管工作难度大及缺乏防范意识等因素是导致广西出现山羊布鲁氏菌病的主要原因。为有效防治布鲁氏菌病的发生流行，建议应加强领导，加大防治经费投入，将防治工作纳入长期发展规划；强化检疫监督执法，重点加强产地检疫工作和引种申报工作，对未经报批擅自引种和依法应当检疫而未经检疫等违法违规行为进行严厉处罚；建立健全扑杀动物补偿制度，对检测出阳性病畜要坚决予以扑杀无害化处理；各部门要加强协作，密切配合，并营造良好的防疫氛围，促使全社会共同参与，努力从动物源头上控制布鲁氏菌病的发生流行，有力保障畜牧业的快速发展与维护人民群众的身体健康。

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