PPIs抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路逆转胃癌细胞的化疗多药耐药*

李建琦 陈 敏 张 松 王 军 许春红 邹晓平

南京大学医学院附属鼓楼医院消化科(210008)

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，早期诊断率低，多数患者确诊时已为进展期胃癌，单纯手术治疗常难以根治，化疗在综合治疗中发挥重要作用，可延长患者术后生存期［1］。然而，诸多因素可导致肿瘤细胞产生多药耐药(multidrug resistance，MDR)，从而影响化疗效果。ATP-结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白超家族成员介导的药物外排作用是导致MDR的重要原因，P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和多药耐药蛋白 1(multidrug resistance protein 1，MRP1)为该家族中与MDR关系最为密切的两个重要成员［2，3］。

缺氧和酸化是肿瘤细胞微环境最主要的特征。肿瘤细胞内外存在pH梯度，胞外pH值偏酸性，胞内pH值偏中性，与肿瘤细胞的存活、生长、侵袭以及对化疗药物耐药有关［4］。肿瘤细胞内无氧糖酵解旺盛，产生大量H+，但仍能维持细胞内外pH梯度，空泡型质子泵(vacuolar H+-ATPases，V-H+-ATPases)在其中起关键调节作用;肿瘤细胞的空泡型质子泵活性极强，在细胞膜和胞内酸性囊泡膜上高度表达［5，6］。质子泵抑制剂(PPIs)预处理能增强肿瘤细胞的化疗敏感性，与其抑制空泡型质子泵活性，逆转肿瘤细胞内外pH梯度，显著增加化疗药物在胞质内的聚集有关［7］。因此，PPIs有望作为一种新型化疗增敏剂和耐药逆转剂应用于临床。

已有研究［8］证实PPIs系通过抑制空泡型质子泵，逆转细胞内外pH梯度而增强胃癌细胞的化疗敏感性，本课题组的前期实验发现该作用与抑制MDR蛋白P-gp、MRP1表达有关。胞外酸化环境可活化胞内PI3K/Akt信号通路［9］，而 PPIs可显著升高胞外pH值，推测PPIs可能对胞内PI3K/Akt信号通路产生抑制作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)不仅是PI3K/Akt信号通路的下游分子［10］，亦为缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的上游关键调节分子［11］，因此推测PPIs可能通过抑制空泡型质子泵，逆转细胞内外pH梯度，进而抑制胞内PI3K/Akt/mTOR信号通路，下调HIF-1α和MDR蛋白P-gp、MRP1表达，从而提高胞内化疗药物浓度，逆转胃癌细胞对化疗药物的MDR。本研究对上述推测进行了验证。

材料与方法

一、胃癌细胞株、药物和试剂

人胃腺癌细胞株SGC7901敏感株由南京鼓楼医院肿瘤科惠赠，SGC7901多药耐药株(SGC7901/MDR)由南京鼓楼医院消化科实验室以阿霉素和顺铂诱导产生。阿霉素对SGC7901和SGC7901/MDR的 IC50分别为(0.654 ±0.103)μg/mL 和(3.203 ±0.302)μg/mL(P ＜0.05)。

注射用埃索美拉唑钠(阿斯利康制药有限公司)，注射用泮托拉唑(德国 Nycomed GmbH);LipofectamineTM2000、DAPI、荧光二抗(invitrogenTM，Life Technologies Corporation)，V-H+-ATPases siRNA(Silencer®Select Pre-Designed ＆ Validated siRNA，ambion®，Life Technologies Corporation)，雷帕霉素(LC Laboratories)，V-H+-ATPases抗体 (Abnova Corporation)，P-gp抗体、MRP1抗体、HIF-1α抗体、hamartin(TSC1)抗体、tuberin(TSC2)抗体、Rheb抗体(Abcam plc.)，PI3K p110α 抗体、Akt抗体、mTOR抗体、phospho/TSC2(Ser939)抗体、phospho/TSC2(Thr1462)抗体、phospho-(Ser/Thr)Akt底物抗体(Cell Signaling Technology，Inc.)，山羊抗鼠、山羊抗兔二抗(杭州联科生物技术有限公司)。

二、实验方法

1.细胞培养:SGC7901/MDR、SGC7901细胞以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基按贴壁方法培养于37℃、5%CO2孵箱内，SGC7901/MDR细胞培养基内含1000 ng/mL阿霉素以维持其MDR表型。

2.PPIs预处理:取对数生长中期 SGC7901/MDR、SGC7901细胞，在pH 6.65的未缓冲培养体系中(弱酸环境可促进PPIs活化)以不同浓度埃索美拉唑或泮托拉唑(0、10、20、50、80、100μg/mL)预处理24 h，收集细胞。

3.siRNA干扰:取对数生长中期 SGC7901/MDR细胞接种于6孔板，以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基按贴壁方法于37℃、5%CO2孵箱内培养24 h，更换为无血清培养基饥饿12 h，于无血清培养基中加入LipofectamineTM2000和V-H+-ATPases siRNA处理24 h，收集细胞。

4.雷帕霉素阻滞:取对数生长中期SGC7901/MDR细胞接种于6孔板，以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基按贴壁方法于37℃、5%CO2孵箱内培养24 h，更换为无血清培养基饥饿12 h，去除培养基，以不同浓度雷帕霉素(0、20、40、80μg/mL)处理24 h，收集细胞。

5.蛋白质印迹法:取上述经不同方式处理的细胞，加入预冷细胞裂解液置冰上裂解30 min，4℃12000 r/min离心(离心半径7.5 cm)，取上清液行蛋白定量。取30μg总蛋白，SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入相应一抗［V-H+-ATPases、PI3K p110α、Akt、mTOR、HIF-1α、TSC1、TSC2、Rheb、phospho/TSC2(Ser939)、phospho/TSC2(Thr1462)、phospho-(Ser/Thr)Akt底物:1∶1000;P-gp:1∶500;MRP1:1∶50)，4 ℃孵育过夜。以含Tween 20的TBST冲洗，加入山羊抗鼠或山羊抗兔二抗(1∶2000)，室温孵育2 h，暗室曝光，扫描图像，以Quantity One 4.4.0凝胶定量软件分析目的蛋白相对表达量。

6.免疫荧光法:将经高压灭菌处理的玻片置入6孔板中，取对数生长中期SGC7901/MDR细胞悬液，以2×105/孔接种于6孔板内玻片上，连续培养24 h，以埃索美拉唑(0、100μg/mL)预处理 24 h 后取出玻片，PBS漂洗3次，冷丙酮固定，山羊封闭血清室温封闭1 h，加入V-H+-ATPases一抗(1∶175)或P-gp一抗(1∶75)，以PBS代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜。加入荧光二抗(1∶150)室温孵育 1 h，加入 DAPI(2μg/mL)染核，1 h 内 DSY5000i倒置荧光显微镜(北京长恒荣创科技有限公司)下观察、拍照。

三、统计学分析

结 果

一、PPIs抑制 SGC7901/MDR细胞内 V-H+-ATPases和 P-gp、MRP1表达

与对照组(0μg/mL)相比，20μg/mL 埃索美拉唑预处理24 h可显著抑制SGC7901/MDR细胞内的 V-H+-ATPases、P-gp 表达(P ＜0.05)，浓度升至50μg/mL 可显著抑制 MRP1表达(P ＜0.05)，抑制作用随药物浓度的升高而增强，呈浓度依赖性(P＜0.05)(见图1A)。然而不同浓度埃索美拉唑预处理对 SGC7901细胞内的 V-H+-ATPases、P-gp、MRP1表达均无明显影响(见图1B)。

与对照组相比，10μg/mL泮托拉唑预处理24 h可显著抑制SGC7901/MDR细胞内的V-H+-ATPases表达(P ＜0.05)，浓度升至 20μg/mL 可显著抑制P-gp、MRP1表达，抑制作用随药物浓度的升高而增强，呈浓度依赖性(P＜0.05)(见图1C)。

经100μg/mL埃索美拉唑预处理 24 h的SGC7901/MDR细胞，免疫荧光法检测显示胞内VH+-ATPases、P-gp表达和定位与对照组相比有明显改变(见图2)。

二、PPIs抑制SGC7901/MDR细胞内PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信号通路

与对照组相比，20μg/mL埃索美拉唑预处理24 h可显著抑制SGC7901/MDR细胞内的PI3K、HIF-1α 表达(P ＜0.05)，浓度升至 50μg/mL 可显著抑制Akt、mTOR 表达(P ＜0.05)，抑制作用随药物浓度的升高而增强，呈浓度依赖性(P＜0.05)(见图3A)。然而100μg/mL埃索美拉唑预处理才能显著抑制SGC7901细胞内的PI3K表达(P＜0.05)，不同浓度埃索美拉唑预处理对Akt、mTOR、HIF-1α表达均无明显影响(见图3B)。

与对照组相比，50μg/mL泮托拉唑预处理24 h可显著抑制 SGC7901/MDR细胞内的 PI3K、Akt、mTOR、HIF-1α 表达(P ＜0.05)，抑制作用随药物浓度的升高而增强，呈浓度依赖性(P＜0.05)(见图3 C)。

三、PPIs对TSC1/2-Rheb信号通路以及Akt底物和TSC2磷酸化的影响

TSC1/2-Rheb信号通路为PI3K/Akt/mTOR信号旁路。与对照组相比，50μg/mL埃索美拉唑预处理24 h可显著抑制SGC7901/MDR细胞内的TSC1、TSC2、Rheb表达(P ＜0.05)，抑制作用随药物浓度的升高而增强，呈浓度依赖性(P＜0.05)(见图4A)。然而80μg/mL埃索美拉唑预处理才能显著抑制SGC7901细胞内的 TSC2表达(P＜0.05)，且浓度达 100μg/mL时TSC2表达不再继续降低;100μg/mL埃索美拉唑预处理才能显著抑制TSC1表达(P＜0.05);不同浓度埃索美拉唑预处理对Rheb表达均无明显影响(见图4B)。

Akt底物的磷酸化水平可直接反映Akt磷酸化调节的作用强度，埃索美拉唑和泮托拉唑预处理24 h均可呈浓度依赖性地抑制SGC7901/MDR细胞内的Akt底物磷酸化;Ser939、Thr1462是 Akt磷酸化TSC2的两个重要位点，埃索美拉唑和泮托拉唑预处理24 h均能在一定程度上抑制这两个位点的磷酸化(见图5)。

图1 PPIs预处理对SGC7901/MDR、SGC7901细胞内V-H+-ATPases和P-gp、MRP1表达的影响

图2 埃索美拉唑预处理对SGC7901/MDR细胞内V-H+-ATPases、P-gp表达和定位的影响(×200)

图3 PPIs预处理对SGC7901/MDR、SGC7901细胞内PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信号通路的影响

图4 PPIs预处理对SGC7901/MDR、SGC7901细胞内TSC1/2-Rheb信号通路的影响

四、PPIs对SGC7901/MDR细胞内TSC1/2复合物表达的影响呈时间依赖性

TSC1、TSC2为抑癌基因，然而PPIs可呈浓度依赖性地抑制SGC7901/MDR细胞内的TSC1/2复合物表达，为此本实验进一步在未缓冲培养体系中以80μg/mL埃索美拉唑分别预处理SGC7901/MDR细胞 15 min 和3 h、6 h、12 h、18 h、24 h，结果显示埃索美拉唑对胞内TSC1/2复合物表达的影响呈时间依赖性，处理 3 h后 TSC1、TSC2表达较对照组(15 min)显著升高(P＜0.05)，18 h后与对照组相比无明显差异，24 h后较对照组显著降低(P＜0.05);TSC1表达于处理12 h后达峰值，TSC2表达处理6 h后即达峰值(见图6)。

图5 PPIs预处理对SGC7901/MDR细胞内Akt底物和TSC2磷酸化的影响

图6 埃索美拉唑预处理对SGC7901/MDR细胞内TSC1/2复合物表达的影响

五、V-H+-ATPases siRNA抑制 SGC7901/MDR细胞内PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信号通路和P-gp表达

V-H+-ATPases siRNA干扰可明显抑制SGC7901/MDR细胞内的 V-H+-ATPases表达(见图 7A)，PI3K、Akt、TSC1、TSC2、mTOR、HIF-1α、P-gp 表达随之显著下调(P＜0.05)(见图7B)，与PPIs预处理结果相似。

六、雷帕霉素阻断mTOR抑制SGC7901/MDR细胞内 HIF-1α、P-gp表达

与对照组相比，20μg/mL雷帕霉素处理24 h可显著抑制SGC7901/MDR细胞内的mTOR表达(P＜0.05)，抑制作用随药物浓度的升高而增强，呈浓度依赖性(P ＜0.05)，浓度升至80μg/mL 时，mTOR表达几乎完全被抑制;HIF-1α、P-gp表达随mTOR表达的下降同步降低(P＜0.05)(见图8)。

图7 V-H+-ATPases siRNA对SGC7901/MDR细胞内PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信号通路和 P-gp表达的影响

图8 雷帕霉素阻断mTOR对SGC7901/MDR细胞内HIF-1α、P-gp表达的影响

讨 论

肿瘤细胞的MDR是一个复杂的多因素现象，与其局部微环境如缺氧、酸化、炎症以及肿瘤细胞本身密切相关［12］。为阐明肿瘤发生的生物学机制，寻找更好的治疗途径，近年来肿瘤细胞代谢及其微环境重新成为研究热点。肿瘤细胞处于一种缺氧、酸化的微环境中，细胞内外存在pH梯度，可激活细胞内部一系列信号转导分子，导致化疗耐药［13］。空泡型质子泵对肿瘤细胞内外pH梯度的维持起关键调节作用，PPIs则可抑制空泡型质子泵活性，逆转肿瘤细胞内外pH梯度，导致胞内pH值偏酸性，胞外pH值偏碱性，并增强胃癌细胞的化疗敏感性［8］。本课题组的前期实验发现PPIs增强胃癌细胞化疗敏感性的作用与抑制 MDR蛋白P-gp、MRP1表达有关。本实验证实PPIs可呈浓度依赖性地抑制SGC7901/MDR细胞内的空泡型质子泵表达，同时抑制P-gp、MRP1表达，对SGC7901细胞内的上述蛋白表达则无明显影响，证实PPIs可通过抑制空泡型质子泵下调MDR蛋白表达并改变其胞内定位，从而提高耐药胃癌细胞的化疗敏感性。

PI3K/Akt信号通路可调节细胞生长、增殖，促进细胞骨架形成。TSC1、TSC2为抑癌基因，位于Akt下游、mTOR上游，是PI3K/Akt信号通路的重要调控位点。这两种基因产物形成的复合物TSC1/2对Rheb(一种大量存在于脑组织中的Ras超家族GTP结合蛋白)具有GAP(GTP酶活化蛋白)活性，是mTOR的关键负性调节因子。Akt激活后磷酸化TSC2的Ser939和Thr1462两个位点，导致TSC1/2复合物解离，对Rheb的抑制作用解除，从而活化下游 mTOR 分子，发挥生物学效应［14～16］。mTOR 不仅是PI3K/Akt信号通路的下游分子，亦为HIF-1α的上游关键调节分子［10，11］。

本实验发现PPIs可呈浓度依赖性地抑制SGC7901/MDR细胞内的PI3K、Akt及其下游分子mTOR、HIF-1α表达以及Akt底物磷酸化，表明PPIs可抑制耐药胃癌细胞内的PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信号通路，然而本实验未能进一步检测PI3K/Akt信号通路中其他中间信号分子的表达情况以及Akt自身的磷酸化状态。后续研究拟完善上述不足，并在应用PPIs的同时或其后上调PI3K/Akt信号通路，如HIF-1α和MDR蛋白表达不受影响，则更能说明PPIs的作用依赖于该通路。此外，本实验还发现PPIs引起的PI3K/Akt信号通路抑制使TSC2磷酸化水平降低，导致TSC1/TSC2复合物表达及其GAP活性在一定时间段内上调，从而抑制Rheb的表达和活性及其下游mTOR分子。表明PPIs还可抑制PI3K/Akt/mTOR信号旁路，通过抑制TSC1/2-Rheb信号通路以抑制其下游mTOR分子而发挥作用。

PPIs对TSC1/2复合物表达的影响呈时间依赖性，提示PI3K/Akt/mTOR信号通路的调控可能存在某种负反馈回路。已有研究证实PI3K/Akt信号通路的下游组分如mTOR可通过抑制胰岛素受体底物蛋白(IRS)功能而阻断该信号通路的进一步活化［17］。由此推测mTOR表达抑制可能反馈性地促进该信号通路活化，进而抑制TSC1/2复合物表达，具体机制有待进一步研究。

空泡型质子泵高表达于肿瘤细胞的细胞膜和胞内酸性囊泡膜，正常组织细胞膜不表达空泡型质子泵，其主要功能为将肿瘤细胞胞质中糖酵解产生的H+泵出胞外或泵入胞内酸性囊泡，以维持胞质内弱碱性或偏中性的环境，此环境与肿瘤细胞对化疗药物耐药密切相关。本研究以V-H+-ATPases siRNA抑制SGC7901/MDR细胞内的V-H+-ATPases表达后，PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信号通路及其旁路分子表达均受抑，MDR蛋白P-gp表达下调，证实了空泡型质子泵在胃癌细胞化疗耐药机制中的重要地位，表明PPIs系通过抑制空泡型质子泵，逆转耐药胃癌细胞的胞内外pH梯度而发挥作用。

mTOR对天然化合物雷帕霉素非常敏感，雷帕霉素对mTOR的抑制作用有极强的特异性［14］。本实验发现雷帕霉素可呈浓度依赖性地抑制mTOR表达，下游HIF-1α、P-gp表达同步降低，雷帕霉素浓度升至80μg/mL时，mTOR表达几乎完全被抑制，HIF-1α、P-gp表达亦如是，证实两者位于mTOR分子下游，表明PPIs系通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，进而抑制HIF-1α和MDR蛋白表达以增强耐药胃癌细胞的化疗敏感性。有研究［18］发现HIF-1α可通过调节p53和NF-κB决定胃癌细胞的化疗敏感性，抑制HIF-1α可使胃癌细胞对5-氟尿嘧啶和顺铂的敏感性显著增强。表明抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路可通过不同途径逆转胃癌细胞对化疗药物的 MDR，包括调节 p53、NF-κB以及下调MDR蛋白等。关于HIF-1α能否通过MDR蛋白参与肿瘤细胞的MDR及其在非缺氧条件下的耐药机制，均有待进一步研究。

综上所述，PPIs可通过抑制耐药胃癌细胞的胞内空泡型质子泵逆转肿瘤细胞内外pH梯度，使肿瘤细胞胞内酸化、胞外碱化，从而改变肿瘤细胞微环境，同时抑制胞内PI3K/Akt/mTOR信号通路，进而抑制HIF-1α和MDR蛋白表达，以增强肿瘤细胞的化疗敏感性，逆转其对化疗药物的MDR。PPIs有望成为一种新型肿瘤化疗佐剂，但目前研究尚处于细胞和动物水平，相关临床试验仍有待开展。

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