酶法水解VC磷酸酯镁及其动力学分析

郎爱花，刘惠青，车 影，闫果兰，靳利娥

（1.太原理工大学 化学化工学院，太原030024；2.山西广播电视大学，太原030027）

具有抗氧化性的维生素C（VC）是人与动物非常重要的营养物质［1－2］。他们自身不能合成，需要从外界摄取足量的VC以供其正常生长发育，但是VC具有很强的还原性，极不稳定，容易被热、光、氧破坏，在中性或碱性溶液中尤为严重［3－4］。VC的不稳定性成为其使用过程中的一大障碍，因此，人们研制出了它的衍生物，VC磷酸酯镁（Magnesium Ascorbyl Phosphate，MAP）就是其中一种。

MAP是一种无嗅、无味的白色粉末，由VC的2位烯醇羟基磷酸酯化而成，是我国批准使用的食品添加剂和营养强化剂［5］。它既具有VC所有的功效，又克服了VC易被光、热及金属离子等氧化的缺点，能长期储存，被广泛应用在食品和医药等行业中［6－7］。磷酸酯酶（Phosphoesterase Complex，PC）能使 MAP水解为VC，发挥VC特有的生理生化功能［8］。因此补充MAP的同时，因人体中磷酸酯酶不足，需要服用适量的磷酸酯酶肠溶片。因此有必要从理论上探讨如何合理利用PC。本研究利用PC体外水解MAP，给出了优化水解最佳条件及其动力学分析，为进一步有效利用MAP提供一定的帮助。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

VC磷酸酯镁，陕西森弗高科实业有限公司；复合磷酸酯酶肠溶片，青岛汉河药业有限公司；其它试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

HH-2型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；DF-Ⅱ集热式恒温磁力搅拌器，江苏金坛市亿通电子有限公司；pHS-3C数显酸度计，上海宇隆仪器有限公司。

1.3 方法

取1g去掉糖衣的复合磷酸酯酶肠溶片溶解在100mL蒸馏水中，配制成酶溶液。放在冰箱中保存备用。取一定量浓度的底物，加酶量，改变pH值，在一定温度下水解，计算水解率。实验通过改变一个反应条件、固定其它反应条件进行单因素实验，利用水解率选择最佳水解条件。在最佳水解条件下改变底物浓度，测定反应速率，拟合反应动力学方程。

VC含量的测定采用国家标准GB／T 7303－2006《饲料添加剂 维生素 C（L-抗坏血酸）》［9］，在酸性介质中VC与碘液发生定量氧化还原反应，利用淀粉指示液遇碘变蓝来判断反应终点，通过计算求得VC的含量，1mL的1mol／L碘标准溶液相当于0.088 06g的 VC。

取水解后溶液1mL，加入0.5mL的冰醋酸，质量浓度为5g／L的淀粉溶液1mL，立即用I2标定，平行3次。水解率按下面的公式计算：

式中：v为水解率；c（I2）为碘标准液浓度，mol／L；V（I2）为消耗碘标准溶液体积，mL；m为 MAP的质量，g。

2 结果与分析

2.1 最佳水解条件的选择

实验考察不同底物浓度、水解时间、反应温度、pH值、加酶量对水解率的影响，选择最佳的水解条件。

2.1.1 不同底物浓度对水解率的影响

取 MAP 溶液质量浓度为 0.43，0.86，1.29，1.72，2.15g／L各5份，每份4mL；分别加入体积分数为5%的PC，在pH为5.5，温度为37℃下水解2h，计算水解率。结果如图1所示。

图1 不同底物质量浓度对水解率的影响

由图1可以看出，随着底物质量浓度的增加，水解率呈增大的趋势。当底物质量浓度为0.43g／L时水解率为4.42%；当底物质量浓度为1.72g／L时，其值达到了21.63%，水解率增加了17.21%；当底物质量浓度为2.154g／L时，水解率为23.38%，比1.72g／L时仅增加了1.75%，所以选择底物质量浓度1.72g／L为最佳底物浓度。

2.1.2 不同水解时间对水解率的影响

取1.72g／L的 MAP溶液4mL共5份，加入体积分数为5%的PC，在pH为5.5，温度37℃下分别水解1，2，3，4，5，8h，计算水解率，结果见图2。

由图2可以看出，随着时间的延长，水解率不断增大，当时间为4h时其值可达32.33%；但随后随着时间的延长，水解率的变化趋于平缓；水解8h时，水解率仅为33.72%。所以选择最佳的水解时间为4h。

2.1.3 不同pH对水解率的影响

取1.72g／L的 MAP溶液4mL共6份，加入体积分数为5%的PC，37℃，分别在pH 为3.0，4.0，5.0，5.5，6.0，7.0条件下水解4h，计算水解率，结果如图3所示。

图2 不同时间对水解率的影响

图3 不同pH对水解率的影响

由图3可以看出，pH为5.5时水解率最大。这是因为每种酶都有其最合适的pH值范围，高于或低于这个范围，酶可能变性或失活。

2.1.4 不同温度对水解率的影响

取1.72g／L的MAP 4mL共6份，加入体积分数为5%的PC，调节pH为5.5，分别在27，32，37，42，47，52℃下水解4h，计算水解率，结果如图4所示。

图4 不同温度对水解率的影响

由图4可以看出，在温度升高的过程中，水解率呈现出先增大后减小的趋势，在37℃时的水解率最大，可达32.58%，故选择最佳的水解温度为37℃。

2.1.5 不同PC量对水解率影响

取1.72g／L的MAP 4mL共6份，调节pH为5.5，使 PC 的体积分数分别为2.5%，5%，7.5%，10%，12.5%，15%，在37℃下水解4h，计算水解率。结果如图5所示。

图5 不同体积分数对水解率的影响

由图5可以看出，随着酶浓度的增加，MAP的水解率迅速增加，当体积分数为5%时，水解率可达33.7%，而后缓慢增大，在体积分数为10%时，其值最大可达35.68%，体积分数增加了1倍，水解度仅增大了1.98%，故选择最佳的体积分数为5%。

综合上述实验结果可以得出：利用PC水解MAP的最佳反应条件为：1.72g／L MAP，PC体积分数为5%在pH为5.5，温度为37℃下水解4h。在此条件下重复三次试验，平均水解率为32.64%±0.42%。

2.2 动力学分析

取底 物 质 量 浓 度 分 别 为 0.43，0.86，1.29，1.72，2.15g／L，在选择出的最适条件下进行水解，计算反应速度，结果如图6所示。可以看出：

随着底物质量浓度ρs的增加反应速率v增大，当增加一定程度时，反应速率达到最大，因此其反应符合米氏方程［10］。利用1／v对1／ρs作图，拟合出Lineweaver-Burk方程为：

结果如图6，图7所示。

计算得：

km＝25.82g／L，vmax＝126.26g／（L·h），

图6 反应速度与MAP浓度的关系

图7 Lineweaver-Buck图

反应动力学方程为：

3 结论

实验优化出复合磷酸酯酶（PC）体外水解Vc磷酸酯镁（MAP）最佳条件为：底物质量浓度1.72g／L，加入1mL PC，在温度37℃，pH＝5.5下水解4h；在该条件下，MAP可被PC最大程度水解，水解率可达（32.64 ±0.42）%；其 水 解 反 应 规 律 遵 循 v＝126.26ρs／（25.82＋ρs）方程，服用复合磷酸酯酶肠溶片可以促进MAP水解，进而有效吸收Vc。

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