内皮脂肪酶启动子-384A/C多态性与老年急性冠脉综合征及血脂的相关性

蔡高军，何国平，戚传平

（江苏大学附属武进人民医院心内科,常州 213000）

内皮脂肪酶（endothelial lipase,EL）是近年来发现的甘油三酯脂肪酶家族新成员，可能通过裂解高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）及其他多条途径参与动脉粥样硬化和冠心病的发病[1]。近年来国内外研究发现EL基因多态性与冠心病关系密切[2,3]。Yamakawa-Kobayashi等[4]和 Hutter等[5]研究均表明EL启动子区-384A/C基因多态性（rs3813082）与血浆HDL水平相关。但到目前为止，EL-384A/C基因多态性是否与中国常州地区汉族人群老年人急性冠脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）发病存在相关性尚未见报到。本研究旨在通过采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism，PCR- RFLP）方法，检测241例老年ACS患者和181例健康体检者的基因型，以了解中国常州地区汉族人群EL-384A/C基因多态性频率分布，并探讨其与老年ACS之间的关系。

1 对象与方法

1.1 对象

2008年8月至2011年1月在江苏大学附属武进人民医院心内科住院的老年ACS患者241例，其中男156例，女85例，年龄60～88岁，平均（69.70±6.77）岁，ACS定义按照美国心脏病学会/美国心脏协会标准[6]，大部分患者进行冠状动脉造影检查，结果由两名有经验的心导管室医师判断。对照组为同期住院并经冠状动脉造影检查排除冠心病者181例，其中男88例，女93例，年龄60～93岁，平均（67.12±6.12）岁。入选患者均为中国常州地区汉族人群。排除标准：患有感染性疾病、风湿性心脏病、严重肝肾功能不全和肿瘤等疾病。该研究征得所有入选对象知情同意。

1.2 方法

1.2.1 一般资料采集 收集所有入选对象的基本资料，包括年龄、性别、高血压史、糖尿病史、吸烟史和冠状动脉造影等结果。

1.2.2 入院次日空腹抽取静脉血检测生化指标 血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和血糖水平检测采用氧化酶法；血清载脂蛋白-A1（apolipoprotein，Apo-A1）、Apo-B 和脂蛋白（a）[lipoprotein（a），LP（a）]水平检测采用放射免疫法。各生化指标均由全自动生化分析仪（奥林巴斯AU5400）检测分析。

1.2.3 EL-384A/C基因型的检测 采用标准酚氯法提取患者外周血基因组DNA，采用PCR-RFLP方法检查EL-384A/C基因型。参照文献[4]合成引物，上游引物 5'-TAG CTC CGC CGG GTT ATT GTG C-3'，下游引物5'-CCA GAT CCT CCT CTC CCC ACT G-3'，引物由大连宝生物有限公司合成。总PCR反应体系50µl，包括 1µl基因组 DNA，5µl 10×PCREx TaqBuffer (Mg2+),4µl dNTP Mixture,0.25µlTaKaRaEx Taq,上下游引物各 1µl，去离子水补充至 50µl。PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性45s，66℃退火45s，72℃延伸45s，共40个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经限制性内切酶HhaI （由大连宝生物有限公司提供）酶切，37.0℃水浴过夜。酶切产物经胶红染色的 3%琼脂糖凝胶 100V电泳45min，紫外灯下观察分型。约10%左右样本被随机重复检查。为证实我们的结果，部分PCR产物送上海生工行基因测序。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用独立样本t检验；计数资料比较采用卡方检验。老年ACS的多种相关因素分析采用logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 对照组与ACS组患者一般资料比较

与对照组相比，老年ACS组患者以男性居多、年龄较大（P＜0.05），高血压、糖尿病和吸烟者比率明显较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。老年ACS组血清TG、TC/HDL-C 和LDL-C/HDL-C明显高于对照组，而血清HDL-C水平明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05；表1）。

表1 对照组与ACS组患者一般资料Table 1 The clinical characteristics controls and ACS group

2.2 EL-384A/C基因多态性位点基因型的鉴定

PCR扩增获得254bp的特异性片段。该片段经HhaI限制性内切酶酶切后显示 AA（254bp）、AC（254bp、142bp和 112bp）和 CC（142bp和 112bp）三种基因型（图1）。

2.3 对照组及老年ACS组EL-384A/C基因型分布

两组 EL-384A/C 基因型分布达到 Hardy-Weinberg平衡（分别为 0.13，1.73；P＞0.05），具有群体代表性。对照组AA、AC、CC基因型和A、C等位基因分布频率分别为 133（73.48%）、45（24.86%）、3（1.66%）和 85.91%、14.09%；老年ACS组 AA、AC、CC基因型和 A、C等位基因分布频率分别为 178（73.86%）、61(25.31%)、2(0.83%)和86.51%、13.49%。两组间基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义（表2）。

图1 EL-384A/C PCR产物酶切电泳图Figure 1 Restriction endonuclease digestion of EL-384A/C PCR products

表2 对照组及ACS组EL-384A/C基因型及等位基因频率分布Table 2 The genotype and allele frequencies of EL-384 A/C between controls and ACS group [n(%)]

2.4 EL-384A/C不同基因型间血脂水平及血脂比值比较

EL-384A/C不同基因型间血脂水平及血脂比值比较，差异均无统计学意义（表3）。

2.5 老年ACS危险因素logistic回归分析

将基因型、性别、年龄、糖尿病、高血压、吸烟和血脂纳入回归模型进行分析，结果显示在校正性别、年龄等因素后，EL-384A/C基因多态性与老年ACS发病仍然无明显相关性（表4）。

表3 不同基因型间血脂水平及血脂比值比较Table 3 Comparison of lipids and the ratios between different genotypes (±s)

表3 不同基因型间血脂水平及血脂比值比较Table 3 Comparison of lipids and the ratios between different genotypes (±s)

注: TC: 总胆固醇; TG: 甘油三酯; HDL-C: 高密度脂蛋白胆固醇; LDL-C: 低密度脂蛋白胆固醇

基因型 n TC(mmol/L) TG(mmol/ L) HDL-C(mmol/ L) LDL-C(mmol/ L) TC/HDL-C TG/HDL-C LDL-C/HDL-C AA 311 4.51±1.01 1.72±1.14 1.16±0.32 2.65±0.76 4.26±1.12 1.73±1.94 2.42±0.89 AC+CC 111 4.67±1.03 1.69±1.14 1.20±0.36 2.75±0.74 4.42±1.17 1.50±1.01 2.43±0.83

表4 老年ACS危险因素logistic回归分析Table 4 The logistic regression analysis of risk factors in aged ACS

3 讨 论

EL定位于人类染色体18q21.1，由483个氨基酸组成，分子量约为 55ku。EL主要由血管内皮细胞合成，与肝脂肪酶、脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase,LPL）三者同属于脂肪酶，共同参与脂蛋白代谢。EL主要表现为较强的磷脂酶活性，作用底物为HDL-C，通过在内皮细胞表面介导HDL-C与硫酸肝素蛋白聚糖结合后，水解HDL-C产生游离脂肪酸和溶血卵磷脂以及Apo-A1，后来研究发现EL也具有较弱的甘油三酯酶活性。

自从2002年deLemos等[7]首次发现EL基因17个多态性位点以来，陆续又有多个新的多态性位点被报道。到目前为止，对于 EL基因多态性是否影响血脂水平以及是否与冠心病发病有关，国内外研究结论尚不一致[2,3,8]。2003年Yamakawa-Kobayashi等[4]研究日本学龄儿童HDL-C水平与EL基因变异的关系时，报道了 6个EL基因变异，并且发现启动子-384A/C和第 10个外显子 2237G/A的变异与HDL-C水平升高有关。2006年，Hutter等[5]对日裔美国人家系人群研究中也发现-384A/C基因多态性与HDL水平有关，并且可能增加人群心血管疾病的患病风险。最近黄焱等[9]对我国成都地区 214名正常人和103例高甘油三酯血症患者EL基因-384A/C位点多态性进行分析，发现中国人EL基因-384A/C多态位点 C等位基因频率为 0.178，但未见正常人和HTG患者之间C等位基因频率存在差异。与AA基因型者比较，正常中国人 C等位基因携带者(AC及 CC型者)血清 HDL水平无显著性差异。本研究发现，中国常州地区汉族人群老年人存在EL-384A/C基因多态性，且这一多态性位点已达到遗传平衡，具有群体代表性。C等位基因频率为13.74%，与 Yamakawa-Kobayashi等和 Hutter等的研究结果一致，但是显著低于黄焱等的报道（P＜0.05），这可能与入选人群不同有关。

对照组与老年 ACS组 EL-384A/C基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义；经校正性别、年龄、糖尿病、高血压、吸烟、高脂血症等冠心病危险因素后，结果仍然表明该多态性与老年ACS无明显相关性。而男性、高龄、糖尿病和 TG是老年ACS发病独立的危险因素。同时本研究发现，与AA基因型者比较，C等位基因携带者（AC+CC）HDL-C水平差异无统计学意义，这与Yamakawa-Kobayashi等和Hutter等[4,5]的研究结果不同，两组间其他血脂水平和血脂比值差异也无统计学意义。出现上述结论不一致的原因可能为：等位基因频率在不同种族人群存在较大差异；确定基因型所使用的试验方案不同，选择偏差不容忽视；许多研究样本数量不够大、统计效能有限。

本研究首次对 EL基因-384A/C多态性与老年ACS的发病进行研究，结果显示EL -384A/C基因多态性与老年ACS的发病无明显相关性，提示该基因变异可能不是中国常州地区汉族人群老年 ACS发病的易感因素。但是由于本文病例数量有限，患者来源于常州地区汉族老年人群，尚需多地区、大样本的研究对其多态性进行检测，以及在功能学方面进一步深入研究。

[1]方玉强,黄 岚,赵晓辉,等.脐静脉内皮细胞高表达内皮脂肪酶后其生物学特性的变化及意义[J].心血管康复医学杂志,2007,16(6): 529-532.

[2]Tang NP,Wang LS,Yang L,et al.Protective effect of an endothelial lipase gene variant on coronary artery disease in a Chinese population[J].J Lipid Res,2008,49(2): 369-375.

[3]Shimizu M,Kanazawa K,Hirata K,et al.Endothelial lipase gene polymorphism is associated with acute myocardial infarction,independently of high-density lipoproteincholesterol levels[J].Circ J,2007,71(6): 842-846.

[4]Yamakawa-Kobayashi K,Yanagi H,Endo K,et al.Relationship between serum HDL-C levels and common genetic variants of the endothelial lipase gene in Japanese school-aged children[J].Hum Genet,2003,113(4): 311-315.

[5]Hutter CM,Austin MA,Farin FM,et al.Association of endothelial lipase gene (LIPG) haplotypes with high-density lipoprotein cholesterol subfractions and apolipoprotein AI plasma levels in Japanese Americans[J].Atherosclerosis,2006,185(1): 78-86.

[6]Chen MS,Bhatt DL.Highlights of the 2002 update to the 2000 American College of Cardiology/American Heart Association acute coronary syndrome guidelines[J].Cardiol Rev,2003,11(3): 113-121.

[7]deLemos AS,Wolfe ML,Long CJ,et al.Identification of genetic variants in endothelial lipase in persons with elevated high-density lipoprotein cholesterol[J].Circulation,2002,106(11): 1321-1326.

[8]Jensen MK,Rimm EB,Mukamal KJ,et al.The T111I variant in the endothelial lipase gene and risk of coronary heart disease in three independent populations[J].Eur Heart J,2009,30(13): 1584-1589.

[9]黄 焱,白 怀,范 平,等.正常中国人及内源性高甘油三酯血症患者内皮脂肪酶基因启动子-384A＞C多态性的研究[J].中华医学遗传学杂志,2008,25(4): 443-446.