贵州黄壤地区葛藤根际溶磷细菌溶磷、分泌IAA及其它特性研究

李显刚，姚 拓，王小利，舒健虹，陆瑞霞

（1.甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州730070；2.贵州省草业研究所，贵州 贵阳 550006）

近年来，如何有效解决我国土壤普遍缺磷，提高土壤磷的循环利用效率成为磷研究方面的热点。利用微生物提高土壤中难溶性磷的生物有效性，对于促进作物增产和环境保护具有重要意义［1－4］，其中植物根际磷细菌与土壤中无机磷的转化、贮藏及供应关系密切，在改善土壤供磷性能和结构方面作用显著［5］。因此，新型溶磷微生物肥料的开发利用潜力巨大。

葛藤（Pueraria lobata）为多年生草质藤本植物，适应性强、耐寒、抗旱，其根、茎、叶、花等都含有丰富的营养，根瘤发达，固氮多，是发展现代农牧业的理想植物。葛藤的茎、枝、叶含有粗蛋白质20.89%～29.20%、粗脂肪2.45%～4.20%、粗纤维26.55%～34.189%、灰分5.91%～9.97%、钙2.11%、磷0.09%和无氮浸出物30.39%～40.70%；同时茎、枝、叶中干物质含量为鲜草重量的22.30%，其中总能量17.53～18.62MJ/kg、消化能11.51MJ/kg、可消化粗蛋白质209g/kg［6］。目前，葛藤的药用、饲用及生态等方面的开发利用价值正在提升，获得了巨大的经济效益、社会效益和生态效益［7］。近年来，溶磷细菌的研究多集中在部分牧草、农作物及土壤中［8－10］，对于藤本类饲料植物研究报道较少。此次对生长于贵州黄壤地区的葛藤根际溶磷菌进行分离，并根据不同菌株的溶磷强度、分泌IAA能力、产酸产碱性能及碳源利用特性筛选优良菌种，为开发利用葛藤根际溶磷微生物资源，提高喀斯特地区黄壤中磷素的循环利用率提供基础材料，同时为葛藤的绿色无公害生产提供磷素营养奠定基础。

1 材料和方法

1.1 样品采集

以5点法采集生长于贵州南部黄壤中（贵州省草业研究所试验地）的葛藤根系及根际土壤样品5份，每份样品重0.5～1.0kg，采样时间为2010年10月；采样地土壤pH 5.97，有机质1.695%，全氮0.218%，水解氮156.98mg/kg，有效磷15.02mg/kg，速效钾为10.20mg/kg。

1.2 溶磷细菌筛选

1.2.1 培养基 分离溶磷菌培养基（PKO）［11］：葡萄糖10.0g、NaCl 0.2g、（NH4）2SO40.5g、MgSO4·7H2O 0.1g、KCl 0.2g、MnSO40.03g、FeSO4·7H2O 0.003g、酵母粉0.5g、琼脂15.0～20.0g、加蒸馏水至1 000mL、pH 6.8～7.2，含磷酸钙3.0g，有改进。保存用LB培养基。

1.2.2 溶磷圈法筛选溶磷细菌 按常规分离细菌法［12］涂布样品悬液于含难溶性磷酸钙的PKO无机磷固体培养基平板上，28℃倒置于恒温培养箱中培养至有类似溶磷菌的分离物后，挑取分离物进行纯化，再点接种于含难溶性磷酸钙的PKO固体培养基上进行溶磷菌株筛选［13］。

1.3 溶磷强度测定

采用钼锑抗比色法测定有效磷含量。接种0.5 mL活化菌株菌悬液装入50mL灭菌的无机磷培养基，28℃、150r/min恒温摇床上振荡培养7d。然后取培养液在10 000r/min转速下离心10min，取适量上清液测磷含量，菌株溶磷量为培养液磷含量减去对照磷含量（以P mg/L表示），酸度计测定培养液pH值。每菌株重复3次，对照不接菌。

1.4 溶磷细菌分泌IAA能力测定

接种0.5mL菌悬液于装有灭菌30mL King液体培养基，同1.3条件震荡培养离心后，取菌株悬浮液1mL滴置于检测板上，加入等量S2比色液，同时在比色液中分别加50μg/mL、30μg/mL、10μg/mL的标准植物生长激素（IAA）1mL作梯度对照，15min内室温下观察其颜色变化，确定菌株是否分泌IAA［14］。分泌IAA的菌株取上清液1mL加S2比色液1mL在黑暗中静置30min后，用紫外分光光度计（530nm）测定吸光度，参照标准曲线计算菌株分泌IAA量（单位：mg/L）。S2比色液：氯化铁4.5g，10.8moL/L浓硫酸1 000mL。

1.5 菌株产酸产碱性能测定

接种分离到的菌株纯培养物于盛有已灭菌30mL NFM液体培养基的三角瓶中，每一菌株3个重复。三角瓶置于28℃恒温摇床上，于125r/min培养72h，观察并记录培养基颜色变化。菌悬液颜色不变色（草绿色或绿色）则为中性菌株；变成黄色，表明其为产酸菌株；变成蓝色为产碱菌株。同时，利用pH酸度计测定菌株悬浮液的pH值，以验证菌株悬液的酸碱性。

1.6 菌株碳源利用特性测定

在LB培养基中分别以甘露醇、蔗糖、1/2甘露醇＋1/2蔗糖、木糖、麦芽糖、葡萄糖取代蛋白胨，制成不同碳源培养基。用接种环挑取适量菌株纯培养物，以平板划线法将其分别接种于不同碳源培养基上，置于28℃的培养箱中培养48h。观察并记录菌株菌落生长情况。

实验数据采用Excel和SPSS16.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 溶磷菌株及其菌落特征

经溶磷圈法筛选，从葛藤根际土壤样品共筛选出8株溶解磷酸钙较强的溶磷细菌。HD（溶磷圈直径）/CD（菌落直径）值及菌落特征见表1。菌株在LB培养基上的菌落特征多乳白色、不透明、半湿润扁平，均不产生色素。8株溶磷细菌在含难溶磷酸钙的无机磷平板上生长10d时 HD/CD值均在2.0以上，其中GTR2产生的溶磷圈最大，菌落最小，HD/CD比值高达6.73，说明GTR2可能具有较强溶磷能力。但多数菌株HD/CD比值在2.1～2.5。培养过程观察发现，多数菌株菌落在1～2d清晰可见，菌株在培养前2d时，透明圈增长快，但不会随培养时间的延长而变大。

2.2 不同菌株溶磷强度

一般地，准确描述溶磷菌溶磷效果的方法是将菌株接种于液体培养基中振荡培养7～10d测定培养液可溶性磷含量［15］。供试菌株经7d的振荡培养后，葛藤根际溶磷菌溶解难溶性磷酸钙的能力有所差异（表2），有效磷含量72.28～159.15mg/L，GTR12、GTR15及GTR2与其余菌株间有效磷含量差异达极显著（P＜0.01）。其中GTR2菌株有效磷含量高达159.15mg/L，溶解磷酸钙能力最强；GTR12、GTR15及GTR4次之。GTR5溶解磷酸钙能力最差，有效磷含量仅为72.28mg/L。不同菌株溶磷能力为GTR2＞GTR12＞GTR15＞GTR4＞GTR11＞GTR6＞GTR3＞GTR5。研究发现，菌株培养液pH值与对照pH值7.0相比均有所下降，其中pH值最低的为3.06（GTR2），最高的为5.46（GTR3和GTR6）。

2.3 不同菌株分泌IAA能力

8株葛藤根际溶磷菌分泌IAA能力定性的显色反应结果表明（表2），多数溶磷菌在具有溶解难溶性磷的同时还具有分泌生长素的功能。其中仅有GTR12无颜色反应，不分泌IAA；GTR15、GTR2、GTR3菌株的显色反应为粉红色，可能具有较强的分泌IAA的能力；菌株GTR5、GTR6、GTR4及GTR11显色反应呈浅粉红色，分泌IAA能力可能较弱。溶磷菌分泌IAA能力的定量测定与定性测定结果具有相对一致性，即GTR15和GTR2显粉红色，分泌IAA量分别为14.44 mg/L和12.71mg/L，均显著高于其余菌株（P＜0.01）。GTR11分泌IAA量最小，为1.25mg/L。

表1 不同菌株HD/CD值及菌落特征Table 1 Colonial characteristics and HD/CD value of different phosphate solubilizing bacteria

表2 不同菌株溶解无机磷及分泌IAA能力Table 2 The ability of different strains for inorganic phosphorus solubilizing and IAA producing

2.4 不同菌株产酸产碱性能

8株溶磷菌株中6株为产碱菌株，占供试菌株的75.00%，菌株培养液颜色为蓝色，pH 值在7.12～7.97。有2株为中性菌株，即GTR3和GTR12，pH值分别为7.02和7.05，菌株培养液颜色为原培养基颜色（绿色）。供试菌株中没有产酸菌株（表3）。

表3 不同菌株产酸产碱性能Table 3 Acid or alkaline producer of different strains

2.5 不同菌株碳源利用特性

供试菌株几乎都能在以甘露醇、蔗糖、1/2甘露醇＋1/2蔗糖、葡萄糖、木糖、麦芽糖为碳源的培养基上良好生长（表4）。其中除GTR5、GTR2、GTR11分别在含甘露醇、蔗糖及1/2甘露醇＋1/2蔗糖、麦芽糖碳源培养基上生长较好外，在其余供试碳源培养基上都能茂盛生长，这可能与各菌株本身特性、对不同碳源利用的差异性及碳源自身性状有关。

表4 不同菌株碳源利用情况Table 4 Features of different strains for utilizing different carbon sources

3 讨论与结论

3.1 讨论

葛藤独特的生态、饲用及药用价值，越来越受到研究者及投资者的关注。据报道，土壤中能够溶解难溶磷酸盐的微生物比例较高，极端情况下高达70%～80%［16］。从贵州黄壤地区葛藤根系及根际土壤中分离获得8株具有较强溶解磷酸钙能力的溶磷细菌，表明葛藤根际中存在大量利用潜力大，且可能具促生、非致病性的溶磷类微生物。供试溶磷菌的HD/CD值在2.14～6.73，多数菌株 HD/CD值高于林启美等［17］测得假单胞菌属培养7d时的 HD/CD值（1.00～3.50），这可能与菌株本身溶磷特点有关［18］。液体振荡培养下溶解磷酸钙的量为72.28～159.15mg/L，与陶涛等［19］从水稻根际分离测得几株溶磷菌的溶磷量102.77～174.08mg/L相当，低于李鹏等［20］从珠芽蓼分离的溶磷内生细菌溶磷量（902.14mg/L），说明不同植物根系及根际土壤中的溶磷细菌对磷酸钙的溶解能力大小各异。此外，有研究表明，不同菌株溶解磷酸钙能力差异较大［21］的原因可能与菌株种类、根际环境及溶磷机理不同有关，同时，植物根际溶磷菌的溶磷量还可能受土壤物理结构、土壤类型及土壤肥力、土壤耕作方式、前茬植物和有机质含量不同等因素影响［22，23］。如各菌株悬液pH值均较对照下降，一方面可能是培养液中Ca－P的存在对pH值变化的缓冲作用逐渐消失所致，另一方面可能是菌株分泌某些酸性物质，致使培养液pH值下降，难溶性磷酸钙溶解。诸如溶磷菌的其他溶磷机理，如菌株在发酵过程中是否产生磷酸酶与溶磷能力大小有关等因素目前尚在试验中。

许多研究表明，存在于植物根际的微生物同时具有多种功能［24］。如众多禾本科及豆科牧草根际联合固氮菌、根瘤菌和溶磷菌具有分泌IAA的能力，分泌的IAA容易在植物根毛区被吸收利用，从而促进植物生长［25］，韩文星等［26］在研究溶磷接种剂对燕麦生长和品质的试验中，得到在含有溶磷菌（同时能分泌IAA）的各处理，燕麦株高、生物量、根长及粗蛋白含量等均显著高于对照。此试验中仅菌株GTR12未分泌IAA，其余溶磷细菌均具分泌IAA能力，如将这些菌株作为接种剂施用，可能会提高葛藤发达的根瘤菌固氮性能及根际磷素的利用率。此外，已有报道称，水稻植株中的内生成团肠杆菌YS19能分泌生长素、细胞脱落酸、赤霉素和细胞分裂素，其中细胞分裂素有3种，即异戊烯腺嘌呤、玉米素核苷和二氢玉米素核苷［27］，鉴于此，作物根际细菌中包括IAA等多种激素产生的普遍性，有利于细菌第2代产物（如铁载体）产生、分子氮的固定、对土传病原物的拮抗和难溶磷酸盐的溶解等，这些对确定根际微生物拥有一个或更多的PGPR特性至关重要。实验将在后期对菌株产生IAA的途径及是否分泌赤霉素等其他激素类物质、对植物的促生效应作深入探讨与研究。

3.2 结论

菌株GTR2和GTR15具有较高溶磷和分泌IAA能力，同时碳源利用范围广，有望作为高效溶磷接种剂的菌种资源。

［1］ 冯瑞章，冯月红，姚拓，等.春小麦和苜蓿根际溶磷菌筛选及其溶磷能力测定［J］.甘肃农业大学学报，2005，40（5）：604－608.

［2］ Wang G H.Solubilization of rock phosphate in liquid culture by fungal isolates from rhizosphere soil［J］.Pedosphere，2005，15（4）：532－538.

［3］ Gothwal R K，Nigam，V K，Mohanl，M K，et al.Phosphate solubilization by rhizospheric bacterial isolates from economically important desert plants［J］.Indian Journal of Microbiology，2006，46（4）：355－361.

［4］ 冯宏，李永涛，张志红，等.类芦根际溶磷真菌的筛选、鉴定及其溶磷能力分析［J］.微生物学通报，2010，37（5）：677－681.

［5］ 田宏，李凤霞，张德罡，等.草坪草溶磷菌筛选及溶磷能力的初步研究［J］.草业科学，2005，22（10）：92－96.

［6］ 刘建林，夏明忠，罗 强，等.葛藤的饲用价值及其在攀西地区畜牧业中的应用［J］.资源开发，2005，21（1）：52－53.

［7］ 王民迪.葛藤的开发和利用［J］.中小企业管理与科技，2009，21：267.

［8］ 蔡磊，李文鹏，张克勤.高效解磷菌株的分离、筛选及其对小麦苗期生长的促进作用研究［J］.土壤通报，2002，33（1）：44－46.

［9］ Souchie E L，Abboud A C D.Phosphate solubilization by microorganisms from the rhizosphere of Pigeonpea genotypes grown in different soil classes［J］.Semina－Ciencias Agrarias，2007，28（1）：11－18.

［10］ 陈俊，陆俊锟，康丽华，等.红树林溶磷菌的初步鉴定、溶磷能力测定及其优化培养［J］.微生物学通报，2009，36（8）：1183－1188.

［11］ 齐文娟，龙瑞军，周万海，等.溶磷菌在5种不同培养基中溶解磷矿粉的性能比较［J］.草原与草坪，2007（5）：37－41.

［12］ Hafeez F Y，Malik K A.Manual on biofertilizer technology［K］.NIBG：Pakistan，2000.

［13］ 朱颖，姚拓，李玉娥，等.红三叶根际溶磷菌分离及其溶磷机制初探［J］.草地学报，2009，17（2）：259－263.

［14］ 席琳乔，张虎，姚拓，等.联合固氮菌固氮、分泌激素和溶磷能力的测定及对燕麦的促生效应［J］.草原与草坪，2005（3）：23－27.

［15］ 杨慧，范丙全，龚明波，等.一株新的溶磷草生欧文氏菌的分离、鉴定及其溶磷效果的初步研究［J］.微生物学报，2008，48（1）：51－56.

［16］ 田宏，姚拓，张德罡.兰州地区草坪草根际溶磷菌分离及溶磷能力初步测定［J］.草原与草坪，2004（4）：39－41.

［17］ 林启美，赵小蓉，孙焱鑫，等.四种不同生态环境土壤中解磷细菌的数量及种群分布［J］.土壤与环境，2000，9（1）：34－37.

［18］ 李凤霞，张德罡，姚拓.高寒地区燕麦根际高效PGPR菌培养条件研究［J］.甘肃农业大学学报，2004，39（3）：316－320.

［19］ 陶涛，叶明，刘冬，等.无机解磷细菌的筛选、鉴定及其溶磷能力研究［J］.合肥工业大学学报，2011（2）：305－307.

［20］ 李鹏，陈秀蓉，李振东，等.珠芽蓼溶磷内生细菌Z14的鉴定［J］.甘肃农业大学学报，2009（6）：85－87.

［21］ Molla M A Z，Chow dhury A A.Microbial mineralization of organic phosphate in soil［J］.Plant and Soil，1984，78：393－399.

［22］ 范丙全，金继运，葛诚.溶解草酸青霉菌筛选及其溶磷效果的初步研究［J］.中国农业科学，2002，35（5）：525－530.

［23］ Kucey R M N，Janzen H H，Legett M E.Microbially mediated increases in plant－available phosphorus［J］.Adv Agron，1989，42：199－228.

［24］ Gibson A H.Genetic variation in the effectiveness of nodulation of Lucerne varieties［J］.Aust J Agic Res，1962，13：388－399.

［25］ 姚拓.高寒地区燕麦根际联合固氮菌研究Ⅱ.固氮菌的溶磷性和分泌植物生长素特性测定［J］.草业学报，2004，13（3）：85－90.

［26］ 韩文星，姚拓，席琳乔，等.PGPR菌肥制作及其对燕麦生长和品质影响的研究［J］.草业学报，2008，17（2）：75－84.

［27］ 沈德龙，冯永君，宋未.成团肠杆菌的生物功能多样性及其分类最新进展［J］.微生物学杂志，2002，22（1）：40－42.