大蒜素对人肺腺癌细胞增殖的影响

钟燕玲，李卫真，赵素梅，刘春生，张永云*

（1.大理学院云南省红会教学医院，昆明 650021；2.云南农业大学基础实验研究中心，昆明 650201；3.云南省第一人民医院肿瘤科，昆明 650032）

钟燕玲1，李卫真2，赵素梅2，刘春生3，张永云2*

（1.大理学院云南省红会教学医院，昆明 650021；2.云南农业大学基础实验研究中心，昆明 650201；3.云南省第一人民医院肿瘤科，昆明 650032）

目的：观察大蒜素对人肺腺癌细胞SLC-89增殖的影响。方法：不同浓度的大蒜素与SLC-89细胞共培养72 h，运用MTT法测定大蒜素的IC50。将IC50、IC50/2、IC50/4剂量的大蒜素与SLC-89细胞共培养72 h后，运用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附法分别测定细胞端粒酶活性，运用流式细胞技术测定细胞PCNA的表达率。加入等量生理盐水共培养作为对照组。结果：大蒜素能抑制SLC-89细胞的增殖，其IC50为79.8μg/mL，IC50和IC50/2剂量的大蒜素能显著抑制SLC-89细胞端粒酶的活性，IC50、IC50/2、IC50/4剂量的大蒜素都能显著抑制SLC-89细胞PCNA的表达。结论：大蒜素能抑制SLC-89细胞的增殖，其PCNA的表达比端粒酶活性更容易受到下调。

大蒜素；端粒酶活性；PCNA；SLC-89细胞；肺腺癌

肺癌是发病率和死亡率均很高、严重危害人类身体健康的恶性肿瘤。目前，化疗仍然是肺癌治疗的主要手段之一，但强烈的副作用常常使患者望而生畏，因此，研究探讨非化疗药物治疗癌症具有十分重要的现实意义。大蒜是人们日常生活中餐桌上的常用调味品，其主要有效成分就是大蒜素（Allicin），具有调节免疫功能、抗菌、抗癌等广泛的生物学效应，从而受到人们的关注〔1〕。云南省宣威县是我国肺癌的高发地区之一，为了有效提高宣威县肺癌的防治水平，本课题组多年前研究建立了云南省宣威县肺腺癌细胞系SLC-89，为肺癌的研究奠定了重要基础〔2〕。本研究观察了大蒜素对云南宣威肺腺癌细胞系SLC-89的影响，为临床上肺癌的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料SLC-89细胞由本课题组传代保株。大蒜素为上海和风制药有限公司生产，规格15 mg/mL。RPMI-1640培养液为Hyclone公司生产，新生牛血清（Newborn cattle serum，NCS）为invitrogen公司生产，四唑氮蓝（MTT）为Sigma公司生产，端粒酶检测试剂盒为德国Boehringerr Manheiman公司生产。增殖细胞核抗原（PCNA）流式抗体PCNA-FITC为NeoMarkers公司生产。PCR扩增仪为美国MJ公司的PTC-100型热循环仪。吸光度值（A）采用美国的DYNEXREVELATION312型酶标仪测定。显微镜为NIKON倒置相差显微镜。

1.2IC50的测定按照文献〔2〕的方法培养SLC-89细胞。将15 mg/mL的大蒜素用生理盐水稀释，参照文献〔3〕报道的MTT方法进行细胞增殖抑制实验并测定大蒜素72 h的IC50。即不同浓度的药液与细胞共培养72 h后，加入MTT并测定相应吸光度值，观察大蒜素对细胞的抑制作用，求出不同浓度药物作用下相应的细胞抑制率，并用SPSS10.0系统软件作回归分析，算出大蒜素的IC50。

1.3 细胞处理在体外37℃、5%CO2的条件下，采用10%NCS的RPMI-1640培养液饲养SLC-89细胞。取对数生长期的细胞制成4.5×104/mL的悬液接种于50 mL小方瓶中，培养24 h后，随机分为对照组及实验组，分别加入生理盐水和实验药液，实验组又分为高、中、低三个浓度组，高浓度组按测定的IC50剂量加入大蒜素溶液，中浓度组按IC50的1/2剂量加入大蒜素溶液，低浓度组按IC50的1/4剂量加入大蒜素溶液，继续培养72 h后消化收集细胞测试以下指标。重复实验5次。

1.4 端粒酶活性的测定按照文献〔3〕报道的方法进行端粒酶活性测定。即消化收集细胞，裂解后取3 μL细胞提取液进行TRAP-ELISA反应。反应参数为：25℃延伸引物30 min，94℃灭活端粒酶10 min，然后进行PCR扩增：94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸90 s，共进行32个循环，最后72℃延伸10 min。取5μL扩增产物与20μL变性液室温下反应10 min，再加入225μL杂交液混匀。ELISA反应板的每孔加入100μL杂交产物，37℃下作用2 h。洗净后加入100μL Anti-DIG-POD工作液反应30 min，洗净后加入100μL TMB液显色反应20 min，加入100μL终止液终止反应。在450 nm/690 nm下测定吸光度值。

1.5PCNA表达率的测定PCNA的测定参照课题组建立的方法〔3〕进行，即消化收集的细胞用PBS缓冲液漂洗后，4%甲醛固定10 min，0.5%TritonX-100破膜10 min。然后用PBS漂洗3遍，加入抗人PCNAFITC流式抗体反应30 min，PBS漂洗3次，流式细胞仪检测分析PCNA的表达率。

1.6 数据统计分析以SPSS10.0统计分析软件进行回归分析和t检验。

2 结果

2.1 大蒜素对SLC-89细胞增殖的影响为了观察大蒜素对LC-89细胞增殖的影响，将不同浓度的大蒜素溶液与SLC-89细胞共培养72 h，MTT法检测细胞的增殖活性。结果显示：大蒜素对SLC-89细胞的生长有明显的抑制作用，细胞生长速度减缓，细胞收缩，由原来的梭形变为圆形，甚至有部分细胞脱落崩解，变成颗粒状无定型的碎片，MTT代谢率显著降低。SLC-89细胞共培养72 h后，求出的回归方程为Y=0.005X+0.101，大蒜素的IC50值为79.8μg/mL。

2.2 大蒜素对SLC-89细胞端粒酶活性的影响不同浓度大蒜素溶液与SLC-89细胞共培养72 h，PCR-ELISA法检测细胞的端粒酶活性，结果显示：高浓度及中等浓度剂量的大蒜素能显著抑制SLC-89细胞端粒酶的活性，而低浓度剂量的大蒜素对SLC-89细胞端粒酶活性的影响没有显著性差异。见表1。

2.3 大蒜素对SLC-89细胞PCNA表达的影响不同浓度大蒜素溶液与SLC-89细胞共培养72 h，流式检测分析结果显示：高浓度、中等浓度及低浓度剂量的大蒜素都能显著抑制SLC-89细胞PCNA的表达。见表1。

表1 不同浓度的大蒜素对SLC-89细胞的影响

3 讨论

作为一种重要的肿瘤细胞分子标志物，端粒酶一直作为肿瘤治疗的主要靶点来广泛研究。我们先前的研究证明：取材于云南宣威这一肺癌高发区患者而建立的细胞SLC-89，是深入研究这一地区肺癌防治的最佳材料，与众多肿瘤细胞一样其端粒酶也是阳性表达，与常用化疗药物共培养后可以通过调控端粒酶等基因的表达而抑制其增殖生长〔3〕。但顺铂的使用，存在着明显的毒副作用。寻找低毒或无毒的治疗方法或治疗药物一直是基础医学研究的重要努力方向。

大蒜是人们常用的调料蔬菜，其球茎中含有的硫键化合物，即大蒜素，具有抗癌功效，其机制包括抗氧化〔4〕、诱导细胞凋亡〔5〕和抑制细胞增殖〔6〕。本研究表明：加入42.12μg/mL的大蒜素可在体外抑制云南宣威肺腺癌SLC-89细胞的增殖生长并显著降低端粒酶活性，抑制PCNA的表达，这个结果与鼻咽癌〔7〕的研究报道类似，也与我们先前关于顺铂的研究结果〔3〕类似。研究提示：云南宣威肺腺癌这一地区多发病与其它恶性肿瘤一样，其作用机制都与端粒酶和PCNA的表达有关。但本研究显示：加入21.06μg/mL的低浓度的大蒜素只能显著抑制SLC-89细胞PCNA的表达，不能显著降低端粒酶的活性，这说明SLC-89细胞的生长增殖更容易受到大蒜素的影响。大蒜素也被证明可以抑制肺癌H460细胞增殖并诱导其凋亡〔8〕，还可抑制血管平滑肌细胞的增殖及PCNA的表达〔9〕，说明其抑制细胞增殖的作用机制可能是广泛存在的。正常机体细胞的凋亡和增殖受多种因素影响，其中端粒酶和PCNA就是两个重要的调控因素。端粒酶是一种RNA依赖的DNA聚合酶，在维持细胞染色体结构的稳定方面发挥着重要作用。降低端粒酶活性、破坏端粒的稳定可使细胞走向死亡。PCNA是一种DNA聚合酶的辅助蛋白，是DNA合成不可缺少的因子，是反映细胞增殖活性的重要指标。研究证明：肿瘤端粒酶活性与PCNA的表达呈正相关，二者都是判断肿瘤恶性程度的重要标志物〔10〕，但本研究结果提示：端粒酶与PCNA对药物的敏感性不一致。尽管大蒜素的确切抗癌机制尚需进一步深入研究，但笔者认为：大蒜素可以通过食疗方式治疗恶性肿瘤，本身就具有十分重要的现实意义，临床研究〔11〕证明：大蒜素与顺铂联合使用，还可减轻其毒副反应。此外，大蒜素还可显著增强机体的免疫耐受能力，提高化疗效果和患者的生存质量〔12〕。这对于放化疗后的肿瘤患者来说，大蒜素的使用更是一种有益的补充，大蒜作为一种餐桌上的调料，值得推广使用。

〔1〕杨俊峰.大蒜素研究进展〔J〕.广州化工，2011，39（1）：32-34.

〔2〕陈志龙，朱玉琨，阎伟，等.云南宣威肺腺癌细胞系SLC-89的建立及其生物学特性〔J〕.细胞生物学杂志，1992，14（3）：119-121.

〔3〕庞荣清，刘春生，潘兴华，等.顺铂对人肺腺癌细胞SLC-89作用的机理探讨〔J〕.中国肺癌杂志，2003，6（3）：469-472.

〔4〕Arranz AI,Haza A,Garca.Protective effectsoforganosulfurcom pounds towards N-nitrosaminc induced DNA damage in the single-cell gelelectrophoresis（SCGE）/HepG2 assay〔J〕. Food and Chemical Toxicology,2007（45）:1662-1669.

〔5〕Hassan H.Joene（natural garlic compound）：a new antileukaemia agent for AML therapy〔J〕.Leuk Res,2004,28（7）：667-671.

〔6〕Sujatha G,Sundaram,John A.Dially disulfide inhibits the proliferation of human tumor cells in culture〔J〕.Biochimicaet Biophysica Acta,1996（1315）：15-20.

〔7〕李葵芳，范德生.大蒜素对CNE-2Z细胞增殖及端粒酶活性的影响〔J〕.宁夏医学杂志，2008，30（7）：584-585.

〔8〕杜亚明，郑伟，王中彬，等.大蒜素对人肺癌H460细胞增殖及凋亡的影响〔J〕.山东医药，2011，51（18）：1-2.

〔9〕杨静，刘德山，高伟.大蒜素对兔血管平滑肌细胞增殖及c-myc基因表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011（31）：622-624.

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〔11〕刘文利，王惠兰.大蒜素注射液减轻顺铂化疗毒副反应的临床观察〔J〕.中国误诊学杂志，2008，8（24）：5829-5830.

〔12〕梁笑倾，谭布珍.大蒜素对提高肿瘤细胞免疫功能的研究进展〔J〕.南昌大学学报：医学版，2010，50（5）：109-111.

*通信作者：张永云，讲师.

（责任编辑 董 杰）

Effect of Allicin on the Proliferation of Human Lung Adenocarcinoma Cell SLC-89 ZHONG Yanling1,LI Weizhen2,ZHAO Sumei2,LIU Chunsheng3,ZHANG Yongyun2*

（1.Second People's Hospital of Yunnan Province,Kunming,650021,China; 2.Basic Experimental Research Center,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China; 3.Department of Oncological Surgery,First People's Hospital of Yunnan Province,Kunming 650032,China）

Objective:To investigate the effect of allicin on proliferation of human lung adenocarcinoma cell line（SLC-89）. Methods:SLC-89 cells were cultured under different doses of allicin for 72 h,the 50%inhibitory concentration（IC50）was measured by MTT method.SLC-89 cells were then cultured with allicin at dose IC50,IC50/2,IC50/4 for 72 h,respectively,telomerase activities of the treated cells were measured by Telomeric Repeat Amplification Protocol with ELISA（TRAP-ELISA）,and expression of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）of the treated cells were tested by flow cytometry.Results:Allicin inhibited proliferation of SLC-89 with IC50of 79.8μg/mL.Allicin at dose of IC50and IC50/2 significantly inhibited telomerase activity of SLC-89 cells,and Allicin at dose of IC50,IC50/2 and IC50/4 significantly inhibited the expression of PCNA of SLC-89 cells.Conclusion:Allicin could inhibit proliferation of SLC-89 cells,compared to the telomerase activity,the expression of PCNA could be down-regulated more easily than by Allicin.

Allicin;telomerase activity;PCNA;SLC-89 cell;lung adenocarcinoma

R734.2

A

1672-2345（2012）06-0032-03

云南省教育厅科研基金资助项目（2011Y440）

2012-03-13

2012-05-08

钟燕玲，主治医师，主要从事临床肿瘤治疗研究.