美洲大蠊提取物对肝星状细胞增殖能力的影响

张小雪，李春艳，徐 静，雷占平，段云忠，赖 泳

（大理学院药学与化学学院，云南大理 671000）

美洲大蠊提取物对肝星状细胞增殖能力的影响

张小雪，李春艳，徐 静，雷占平，段云忠，赖 泳*

（大理学院药学与化学学院，云南大理 671000）

目的：研究美洲大蠊提取物样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对体外培养大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）增殖的影响。方法：用四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）法检测不同浓度样品在不同培养时间作用下HSC-T6细胞的增殖能力。结果：与空白对照组比较，样品Ⅰ抑制了HSC-T6的增殖，且随时间的延长抑制作用加强，在一定的浓度范围内具有剂量依赖性，培养72 h时作用最强。样品Ⅱ与样品Ⅰ作用效果相似，但抑制作用略小于样品Ⅰ。样品Ⅲ在作用24 h时，有一定抑制作用，而在其他时间段基本没有抑制作用。结论：样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均能抑制HSC-T6的增殖，有可能成为防治肝纤维化的理想药。

肝星状细胞；美洲大蠊提取物；细胞增殖；抑制作用

肝纤维化是慢性肝病发展至肝硬化甚至原发性肝细胞癌的必经阶段，是各种慢性肝病的共同病理学基础，研究表明如果不经过合理的治疗，其中约10%的患者5~10年后发展成为肝硬化，如果能阻滞或逆转肝纤维化进展，将显著改善肝病患者的生存质量和预后〔1〕。肝纤维化的机制主要是肝脏细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过量产生和降解减少，导致ECM在肝脏沉积，形成纤维化。肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）是参与肝纤维化过程的最主要细胞成分〔2〕，其活化后大量增殖及生成胶原等细胞外基质。抑制HSC活化、增殖已成为抗肝纤维化的中心策略。本实验以体外培养大鼠HSC-T6细胞株为研究对象，设定不同浓度的美洲大蠊提取物进行干预，观察美洲大蠊提取物对HSC-T6细胞增殖的影响，在细胞水平上探讨美洲大蠊提取物抗肝纤维化的初步作用。

1 材料

1.1 药物样品Ⅰ、样品Ⅱ、样品Ⅲ由云南大理学院李树楠教授提供；样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶于无血清的改良Eagle培养基（DMEM）中，用0.22μm微孔滤器过滤，配成浓度为10 mg/mL的母液储存于4℃冰箱备用。用时用含有10%的DMEM稀释，样品Ⅰ、样品Ⅱ、样品Ⅲ终浓度分别为5 000、1 000、200、40、8、1.6、0.32、0.064μg/mL。

1.2 细胞HSC-T6细胞株购自上海弗雷堡生物科技发展有限公司。

1.3 主要试剂DMEM（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司生产）；0.25%胰蛋白酶（Solarbio）；MTT（二甲基噻唑二苯基四唑嗅盐）为Amresco公司生产。

1.4 主要仪器连续波长酶标仪（BIO-Tek公司）、Olympus IX-7型倒置相差显微镜、水套式CO2细胞培养箱（美国thermo）、Yj-1450型无菌操作台（苏州安泰空气技术有限公司）、高Es-315型压灭菌器（日本Tomykogyo公司）。

2 方法

2.1 细胞接种HSC-T6用含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2条件下培养，取对数生长期细胞用于实验，将其稀释成5×104/mL的浓度，接种于96孔板，每孔100μL，5%浓度的CO2条件，37℃培养24 h〔3〕。

2.2 美洲大蠊提取物对HSC-T6的影响实验在已培养24 h的HSC-T6细胞，分别加入8个浓度梯度的样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，使其最终浓度分别为5 000、1 000、200、40、8、1.6、0.32、0.064μg/mL，同时设置阴性对照组和空白对照组，每组至少设3个复孔。放入37℃，5%浓度的CO2培养箱内进行培养，分别培养24、48和72 h后，每孔加入MTT溶液20μL，继续培养4 h后，弃去上清后每孔分别加入DMSO，待每孔紫色结晶溶解后，在波长495 nm检测各孔OD值〔4〕。

2.3 统计学方法采用SPSS（17.0）统计软件进行处理，各组数据进行t检验，数据以x±s表示。

3 结果

3.1 结果处理样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对HSC细胞生长抑制率按下述公式计算：

抑制率%=（1-OD实验组/OD对照组）×100%。

3.2 样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ24 h对HSC-T6细胞增殖的抑制作用与阴性对照组比较，培养24 h后，样品Ⅰ在浓度为5 000和1 000μg/mL时对HSC-T6的增殖有明显抑制作用（P＜0.01），在浓度为200μg/mL时对HSC-T6的增殖有一定抑制作用（P＜0.05）；样品Ⅱ在浓度为5 000和1 000μg/mL时对HSC-T6的增殖有明显抑制作用（P＜0.01），在浓度为200和40μg/mL有一定抑制作用（P＜0.05）；样品Ⅲ在浓度为5 000μg/ mL时有一定抑制作用（P＜0.05），其余浓度组无明显抑制作用（P＞0.05）。见表1、图1。

表1 样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用24 h对HSC细胞增殖的抑制作用（

表1 样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用24 h对HSC细胞增殖的抑制作用（

注：阴性对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01。

剂量/（μg/mL） 抑制率（x±s）样品Ⅰ 样品Ⅱ 样品Ⅲ5 000.000 69.16±12.24** 79.17±14.77** 38.55±7.57*1 000.000 52.20±24.45** 68.64±24.44** 12.64±18.05 200.000 44.98±8.87* 51.19±24.50* -7.91±2.35 40.000 36.09±9.02 48.37±22.81* -18.07±4.34 8.000 31.00±10.11 36.41±4.52 -17.76±6.02 1.600 34.51±7.79 39.95±9.85 -19.05±7.71 0.320 30.77±6.63 37.06±7.34 -22.66±6.78 0.064 25.65±8.05 28.61±3.20 -22.00±7.58

图1 样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用24 h对HSC细胞增殖的抑制率

3.3 样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在对HSC细胞作用48 h的增殖影响与阴性对照组相比较，样品Ⅰ在浓度为5 000、1 000、200、40、8μg/mL时对HSC的增殖有明显抑制作用（P＜0.01），且在浓度为1.6及0.032μg/mL对HSC-T6增殖有一定抑制作用（P＜0.05）；样品Ⅱ在浓度为5 000、1 000、200、40及8μg/mL时对HSC-T6增殖有明显抑制作用（P＜0.01），且在浓度1.6μg/mL时有一定抑制作用；样品Ⅲ的作用不明显（P＞0.05）。见表2、图2。

表2 样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用48 h对HSC细胞增殖的抑制作用

表2 样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用48 h对HSC细胞增殖的抑制作用

注：阴性对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01。

剂量/（μg/mL） 抑制率（x ±s）样品Ⅰ 样品Ⅱ 样品Ⅲ5 000.000 53.20±5.32** 61.14±10.27** 21.74±4.83 1 000.000 43.77±5.03** 52.90±13.83** 7.12±3.25 200.000 43.48±6.61** 41.97±8.64** 4.16±2.97 40.000 40.50±11.72** 41.38±10.09** 2.44±0.58 8.000 37.84±10.25** 39.33±9.70** -0.30±0.17 1.600 32.71±13.63* 33.12±15.82* -6.98±3.24 0.320 32.04±10.11* 30.28±15.02 -4.24±1.17 0.064 -58.96±12.32 0.41±0.15 -4.14±5.32

图2 样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用48 h对HSC细胞增殖的抑制率

3.4 样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用72 h对HSC细胞增殖的抑制率与阴性对照组比较，样品Ⅰ在浓度为5 000、1 000、200、40、8、1.6及0.32μg/mL时对HSC细胞增殖的抑制有明显作用（P＜0.01）；样品Ⅱ在浓度为5 000、1 000、200、40、8、1.6及0.32μg/mL时对HSC细胞增殖有明显的抑制作用（P＜0.01）；样品Ⅲ无明显抑制作用。见表3、图3。

4 讨论

病毒感染、长期饮酒等均可导致慢性肝损伤而发展成肝纤维化，部分患者可发展为肝硬化及原发性肝细胞癌。肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的必经途径〔3〕，根据疾病发展的不同阶段，采取抗肝纤维化治疗为一种有效手段。关于抗肝纤维化的研究近年来有不少报道，但目前临床治疗肝纤维化的西药中疗效确切、不良反应少的药物较少且大多还处在实验研究阶段。中药在抗肝纤维化治疗中具有明显的优势，且主要来源于植物或动物。而昆虫作为一类新的医药资源宝库，其药用价值值得深入研究。

表3 样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用72 h对HSC细胞增殖的抑制作用

表3 样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用72 h对HSC细胞增殖的抑制作用

注：阴性对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01。

剂量/（μg/mL） 抑制率（x ±s）样品Ⅰ 样品Ⅱ 样品Ⅲ5 000.000 67.70±2.94** 64.42±17.10** -26.90±5.67 1 000.000 61.15±6.21** 69.00±10.88** -17.41±4.38 200.000 67.05±4.66** 65.35±4.68** -23.08±7.74 40.000 68.54±3.36** 63.63±8.05** -36.59±8.64 8.000 65.76±4.71** 69.64±3.08** -7.56±2.56 1.600 66.94±4.17** 59.72±14.55** -8.04±5.12 0.320 61.98±4.23** 59.58±7.85** -6.97±3.45 0.064 -83.35±12.34* 4.96±1.61 -15.66±6.12

图3 样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用72 h对HSC细胞增殖的抑制率

蜚蠊科大蠊属昆虫美洲大蠊具有抗肝炎、抗肿瘤、抗菌、抗艾滋病病毒、增强机体免疫力、消炎镇痛、促进血管增生、组织修复等作用〔5-8〕。文献报告美洲大蠊提取物具有抗实验性肝纤维化的作用，但作用机制尚不明确〔9〕。在肝纤维化形成的过程中，肝星状细胞的“持久化”激活和增殖是中心环节，阻抑激活的HSC增殖和诱导促进HSC凋亡是防治肝纤维化的重要措施。因此，肝星状细胞的激活及增殖最终是导致肝硬化、肝功能衰竭的主要原因。本实验从细胞水平，观察样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对HSC细胞增殖的抑制作用，实验研究结果表明：美洲大蠊提取物可以抑制肝星状细胞的增殖，且样品Ⅰ、Ⅱ在一定浓度范围内呈量效关系，样品Ⅲ对肝星状细胞增殖的抑制作用弱于样品Ⅰ、Ⅱ。

综上所述，美洲大蠊提取物能抑制体外肝星状细胞的增殖，起到抗肝纤维化作用，为美洲大蠊的临床应用提供了新的理论依据。

〔1〕马雄，魏珏.非酒精性脂肪性肝炎相关肝纤维化的研究现状〔J〕.内科理论与实践，2008，3（1）：18-22.

〔2〕Henderson NC,Iredale JP.Liverfibrosis:cellularmechanisms of progression and resolution〔J〕.Clin Sci（Lond），2007，112（5）：265-280.

〔3〕王怡，薛绍礼，张菁，等.三七总皂甙对传代肝星状细胞增殖的影响〔J〕.淮海医药，2008，26（1）：1-3.

〔4〕朱晓云，祁鑫，王兆礼，等.化痰散结中药对甲状腺细胞增殖与凋亡影响的实验研究〔J〕.河南中医学院学报，2009，24（140）：31-34.

〔5〕胡艳芬，吕小满，刘光明，等.美洲大蠊提取物对3株人肺癌细胞的体外抑制作用〔J〕.大理学院学报，2009，12（8）：1-3.

〔6〕何正春，胡明辉，王晓雨，等.美洲大蠊提取物对3株人及小鼠白血病细胞的细胞毒性研究〔J〕.云南中医中药杂志，2009，30（5）：56-57.

〔7〕焦春香，刘光明，周萍.天然药物康复新的研究进展〔J〕.时珍国医国药，2008，19（11）：2623-2624.

〔8〕戴云，曾茗，项朋志.蜚蠊的药用价值〔J〕.中药材，2005，28（9）：848-850.

〔9〕李武，段丽芳，何贵清，等.美洲大蠊提取物对实验性肝纤维化的影响〔J〕.时珍国医国药，2010，21（5）：1137-1138.

（责任编辑 毛本勇）

Cell Proliferation Effect of Periplaneta americana Extracts on Hepatic Stellate Cells

ZHANG Xiaoxue,LI Chunyan,XU Jing,LEI Zhanping,DUAN Yunzhong,LAI Yong*
（College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the proliferation effects of Periplaneta americana extracts（samplesⅠ,Ⅱ,Ⅲ）on rat hepatic stellate cell lines（HSC-T6）in vitro.Methods:HSC-T6 proliferation under the treatment of Periplaneta americana extracts in different concentration and time was determined by MTT method.Results:Compared with the control group,HSC-T6 proliferation was inhibited by sampleⅠ with time dependence and reached the peak at 72 hours with concentration dependence within a certain range.SampleⅡ showed the same inhibitory pattern but with less effect.SampleⅢ showed a particular inhibition effect in 24 hours,and no effect at other time points.Conclusion:The samplesⅠ,Ⅱ,Ⅲ can inhibit hepatic stellate cell proliferation,which may be a potential drug for prevention and treatment of liver fibrosis.

hepatic stellate cells;Periplaneta americana extracts;cell proliferation;inhibition

R285.5

A

1672-2345（2012）06-0016-04

大理学院大学生科研基金项目（DXSKYX201020）

2012-01-04

2012-03-08

张小雪，药学专业2009级本科生. *通信作者：赖泳，副教授.