牛肝菌对小鼠免疫功能影响的实验研究

王 涛，李丽娟，申元英

（大理学院，云南大理 671000）

牛肝菌对小鼠免疫功能影响的实验研究

王 涛，李丽娟，申元英*

（大理学院，云南大理 671000）

目的：探讨牛肝菌对小鼠免疫功能的影响。方法：将牛肝菌的水溶液和脂溶液分别灌胃小鼠10 d，检测小鼠免疫器官重量、巨噬细胞吞噬能力、T淋巴细胞增殖情况及细胞因子产生的情况。结果：牛肝菌脂溶组中小鼠的多数指标均高于水溶组；并且牛肝菌对雌性小鼠的免疫增强作用强于雄性小鼠。结论：牛肝菌有增强免疫功能及抗肿瘤的作用。

牛肝菌；免疫活性；小鼠

牛肝菌是一种在世界各地均广泛分布的野生食用菌，因其野生子实体内富含多种氨基酸、维生素、矿质元素、蛋白质、活性多糖等人体所需的营养成分，且香味浓郁，味道鲜美，深受人们喜爱〔1-2〕。目前，国内外对于牛肝菌的研究众多，主要集中于牛肝菌的抗氧化方面，如Kasuga等〔3〕研究了乳牛肝菌中抗氧化活性成分，国内学者也对此进行了大量研究〔4〕。但对于牛肝菌增强机体免疫功能方面的研究较少。已有研究表明：牛肝菌可增强机体免疫功能〔5〕。因此，本文以云南野生牛肝菌的水提剂和醇提剂为受试药物，通过连续灌胃小鼠10 d后，检测其免疫功能。旨在探讨牛肝菌醇提取物对小鼠免疫功能的影响。

1 材料和方法

1.1 受试药品由大理学院药学院药物研究所提供，提取率为21%，使用冷冻法干燥。

1.2 实验动物昆明种小鼠由昆明医科大学动物中心提供，共计140只，雌雄各半，4~6周龄，体重18~ 22 g。实验动物许可证号：scxk（滇）2005-0008。

1.3 主要仪器和试剂连续波长酶标仪（PowerwaveXS，美国），CO2培养箱（SANYO，日本），二甲基亚砜（DMSO，天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：070707）；注射用环磷酰胺（CTX）（山西普德药业有限公司，批号：20100307）；小牛血清（北京奥博星生物技术责任有限公司，批号：20100303）；RPMI-1640（Invitrogen公司，批号：1313945）；植物血凝素PHA（Solarbio Life sciences，批号：P8090）；四噻唑盐（MTT，Sigma公司）；Mouse IL-2 ELISA检测试剂盒（Quantikine，批号：281038）；Mouse TNFαELISA检测试剂盒（Quantikine，批号：282254）。

1.4 实验分组牛肝菌（NGJ）样品溶解时使用超纯水（ddH2O）和二甲基亚砜两种溶剂；环磷酰胺、二甲基亚砜和超纯水组为阴性对照组；实验中NGJ含量为200 mg/kg，CTX含量为40 mg/kg，DMSO含量20 mL/kg，ddH2O含量为20 mL/kg。采用随机区组法，按性别将140只小鼠分为14个小组，分别用A-N表示，每组10只。具体分组见表1。

表1 牛肝菌对小鼠免疫功能影响的实验分组

1.5 检测方法1次/d灌胃小鼠，10 d后通过对小鼠的脏器/体重比值、吞噬功能和T淋巴细胞增殖及细胞因子的测定，检测牛肝菌醇提取物对小鼠免疫功能的影响。

1.5.1脏器/体重比值测定 小鼠颈椎脱臼处死称重后，立即取出胸腺和脾脏，用滤纸吸干血液后称重，胸腺（脾）指数单位：胸腺（脾）质量/小鼠体质量（mg/10 g）。

1.5.2吞噬功能 处死动物前3 d，以5%的淀粉肉汤启动小鼠巨噬细胞，采用半体内法检测腹腔巨噬细胞吞噬功能，以100个巨噬细胞中吞噬酵母菌的巨噬细胞数（吞噬率）及每个巨噬细胞吞噬酵母菌的个数（吞噬指数）作为评价指标。

1.5.3MTT法测定T淋巴细胞增殖 无菌取出脾脏，制成脾细胞悬液，用RPMI-1640不完全营养液洗涤3次，1 000 rpm离心10 min，然后用完全营养液配成1×107/mL。取100μL加入96孔细胞培养板内，每孔1×106个细胞，每个样品做3个复孔。再加入240 mg/L的PHA 20μL，使终浓度为40 mg/L，同时设不加PHA的对照孔，置37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后，每孔加入10μL MTT溶液（5 g/L），再继续培养4 h，离心，弃上清液，然后加入30%DMSO 100μL，充分振荡后静置20 min，用酶标仪于波长570 nm处测A值。

1.5.4细胞因子的检测 将动物用乙醚麻醉以后，摘眼球取血，将血液静置离心后，获得血清，用ELISA法测IL-2及TNFα，具体按试剂盒说明操作步骤进行。

1.6 统计学分析应用SPSS 17.0软件对数据进行分析。显著性检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 不同处理小鼠脏器/体重指数比较

2.1.1胸腺指数 胸腺指数是衡量机体免疫功能的指标之一。由表1可知，从总体上看，不同处理组中小鼠的胸腺指数均高于阴性对照组。其中，脂溶组的胸腺指数最高，其次为水溶组，最后为牛肝菌和环磷酰胺组。除水溶组外，其他处理组中雌性小鼠的胸腺指数均高于雄性，差异有统计学意义（P＜0.05）。牛肝菌水溶组中：雄性组的胸腺指数高于对应的溶剂对照组（P＜0.05），而雌性组则无此变化。

2.1.2脾指数 不同处理组小鼠的脾指数见表1。由表1可知，脂溶组小鼠的脾指数高于水溶组；环磷酰胺脂溶组小鼠的脾指数高于脂溶组和水溶组（P＜0.05）；不同处理组中雌性小鼠的脾指数均高于雄性，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 不同处理小鼠吞噬功能比较通过比较不同处理后小鼠吞噬率和吞噬指数发现，不同处理组之间小鼠的吞噬率和吞噬指数差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 不同处理小鼠T淋巴细胞增殖比较对不同处理组小鼠的T淋巴细胞增殖进行比较发现：脂溶组小鼠的T淋巴细胞增殖强于水溶组；环磷酰胺脂溶组小鼠的T淋巴细胞增殖强于环磷酰胺水溶组（P＜0.05）；不同处理对雌性和雄性小鼠的T淋巴细胞增殖影响不大。

2.4 不同处理小鼠细胞因子比较

2.4.1细胞因子IL-2 除环磷酰胺雌性组与其余各组中细胞因子IL-2差异均有统计学意义（P＜0.05），其余组之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.4.2细胞因子TNFα 对于细胞因子TNFα，不同处理组之间差异较大，见表1。

3 讨论

目前报道的牛肝菌营养成分中，野生牛肝菌中硒的含量非常丰富〔6〕，而硒具有抗氧化及增强机体免疫力的作用；美味牛肝菌的油脂成分具有增强机体免疫能力、抗肿瘤的作用〔7〕。

本研究通过不同处理后，测定小鼠的脏器/体重比值、吞噬功能和T淋巴细胞增殖及细胞因子，结果显示：脂溶组中小鼠的大多数指标均高于水溶组，提示牛肝菌水溶剂对正常小鼠的免疫增强作用弱于脂溶剂；并且牛肝菌对雌性小鼠的免疫增强作用强于雄性小鼠，其机理有待于进一步研究。与刘佳等人研究结果相比较〔6〕，本研究实验组NGJ+CTX水溶组，NGJ+CTX脂溶组的胸腺指数均较其牛肝菌9 g/（kg·bw）+CTX50 mg/（kg·bw）组胸腺指数高，提示本实验方案的剂量组合效率较高。

表1 牛肝菌对小鼠免疫功能的影响（

表1 牛肝菌对小鼠免疫功能的影响（

注：A：P＜0.05，vs NGJ水溶 雌性；B：P＜0.05，vs NGJ水溶 雄性；C：P＜0.05，vs NGJ酯溶 雌性；D：P＜0.05，vs NGJ酯溶 雄性；E：P＜0.05，vs NGJ+CTX水溶 雌性；F：P＜0.05，vs NGJ+CTX水溶 雄性；G：P＜0.05，vs NGJ+CTX酯溶 雌性；H：P＜0.05，vs NGJ+ CTX酯溶 雄性；I：P＜0.05 vs其余各组；J：P＜0.05 vs NGJ水溶 雄性，NGJ酯溶 雌性，NGJ酯溶 雄性，NGJ+CTX水溶 雌性；K：P＜0.05 vs NGJ+CTX酯溶 雌性，DMSO，ddH2O，CTX；L：P＜0.05 vs NGJ+CTX酯溶雌性，DMSO，ddH2O，CTX；M：P＜0.05 vs ddH2O；N：P＜0.05 vs ddH2O，CTX雄性。

分组 胸腺指数 脾指数 淋巴细胞增殖 吞噬率 吞噬指数 IL-2 TNFα A 25.40±3.88 32.05±4.56 0.74±0.28 0.015±0.02 1.17±0.00 7.65±11.15 23.19±5.32jB 25.63±4.86 28.45±3.95 0.65±0.22 0.39±0.11 2.08±0.83 6.51±4.66 153.31±156.67kC 38.90±16.34a 35.41±11.00 0.83±0.11 0.23±0.18 1.81±0.29 4.09±1.26 168.88±102.97lD 20.77±14.18c 29.72±4.71 0.92±0.43b 0.28±0.00 1.39±0.00 5.43±4.66 136.86±274.87mE 25.72±8.81 27.16±5.45 0.74±0.17 0.27±0.16 1.65±0.48 5.67±0.76 28.31±3.48nF 19.98±18.68 16.39±5.90 0.49±0.26e 0.23±0.03 1.70±0.34 5.90±0.78 42.42±35.11 G 29.72±12.08 53.84±18.85c,e 1.15±0.57e 0.26±0.06 1.77±0.62 5.42±0.99 26.11±4.28 H 20.55±5.93 47.85±18.93d,f,g 1.15±0.53f 0.32±0.20 1.93±0.45 6.48±1.01 21.47±1.44 I 38.59±13.94 37.30±13.22 0.74±0.19 0.37±0.28 2.37±0.86 4.34±1.46 21.47±1.44 J 18.52±8.36 28.72±6.17 0.82±0.16 0.36±0.17 2.06±0.73 5.09±4.38 28.97±20.24 K 25.31±3.77 27.69±7.56 0.61±0.13 0.26±0.06 1.70±0.24 5.04±2.87 17.09±4.81 L 9.71±2.69b 26.07±4.51 0.66±0.25 0.27±0.81 1.71±0.31 3.82±1.44 18.93±7.18 M 32.82±10.37 44.87±24.48e 0.57±0.21g 0.28±0.15 1.95±0.60 6.15±1.19i 30.24±9.37 N 12.96±6.09 38.75±15.50f 0.59±0.16h 0.25±0.19 2.29±0.83 12.34±6.96 26.82±6.83

TNF各组之间存在不同程度的差异，主要集中于NGJ水溶组及酯溶组与其余各组之间；提示牛肝菌的水溶提取物及酯溶提取物均有较高的抗肿瘤作用。

综上所述，根据免疫功能检验方法〔8〕的判定标准（脏器/体重比值测定和淋巴细胞增殖转化试验阳性），说明牛肝菌有增强免疫功能的作用及抗肿瘤作用。但牛肝菌水溶液的免疫增强作用弱于脂溶液和雌性小鼠的免疫增强作用强于雄性小鼠的机理、牛肝菌具体的功效成分、作用强度、以及剂效关系等有待于进一步研究。

〔1〕周玲仙，殷建忠.云南野生食用牛肝菌营养成分分析及评价〔J〕.食用菌，2008，30（4）：61-62.

〔2〕李娟，李平，卜可华.几种牛肝菌抗氧化能力的研究〔J〕.中国食品添加剂，2007（1）：49-53.

〔3〕Kasuga A，Aoyagi Y，Sugahara T.Antioxidant activity of fungus Suillus bovinus（L：Fr）O.Kuntze〔J〕.Journal of Food Science，1995（60）：1113-1115.

〔4〕王一心，杨桂芝，狄勇.华美牛肝菌对高脂血症大鼠血脂及抗氧化作用的影响〔J〕.现代预防医学，2004（4）：479-480.

〔5〕唐薇，鲁新成.美味牛肝菌多糖的生物活性及其抗S-180肿瘤的效应〔J〕.西南师范大学学报，1999，24（4）：478-481.

〔6〕刘佳，高敏，殷忠，等.野生牛肝菌营养成分分析及对小鼠免疫功能的影响〔J〕.微量元素与健康研究，2007，1（1）：5-7.

〔7〕李志洲.美味牛肝菌中油脂成分的提取及其成分分析〔J〕.氨基酸和生物资源，2009，31（2）：17-20.

〔8〕阚国仕，矫丽曼，杨玉红，等.牛肝菌胞外多糖体外抗氧化能力的研究〔J〕.食品与发酵工业，2009，35（2）：57-60.

*通信作者：申元英，教授.

（责任编辑 毛本勇）

Effect of Bolete on Mice Immune Function

WANG Tao,LI Lijuan，SHEN Yuanying*
（Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To observe the effect of bolete on immune function of mice.Methods:Intragastric administration of bolete in aqueous solution or in lipid solution into the mice for 10 days consecutively.Organ weight of thymus and spleen,phagocytic capacity of macrophage,proliferation of T lymphocyte and cytokines inducement were investigated.Results:Indexes of lipid solution group were higher compared with that of aqueous group.Bolete manifested obvious effect on immunologic enhancement of female mice compared with the male mice.Conclusion:Bolete could enhance immune function and show anti-tumor effect in mice.

bolete;immunity;mice

R34

A

1672-2345（2012）06-0020-03

云南省中青年学术技术带头人后备人才培养基金资助项目（2006PY057）

2012-01-10

2012-04-14

王涛，实验师，主要从事预防医学研究.