莫诺苷对二磷酸腺苷诱导兔血小板聚集后环氧酶的影响

孙盼莉，魏守蓉，王晓锋，王，陈乃宏，薛存宽，刘浩

莫诺苷对二磷酸腺苷诱导兔血小板聚集后环氧酶的影响

孙盼莉1,2，魏守蓉1，王晓锋2,3，王文2，陈乃宏3，薛存宽1，刘浩1

目的研究莫诺苷对二磷酸腺苷(ADP)诱导兔血小板聚集后环氧酶(Cox)含量的影响。方法利用酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)检测不同给药组间ADP诱导体外分离的兔血小板聚集后Cox的含量。结果与空白对照组相比，莫诺苷各剂量组均能显著降低ADP诱导兔血小板聚集后Cox的含量(P＜0.001)，并具有较好的浓度依赖性，其中高剂量组抑制率达30%左右。结论莫诺苷可能通过影响Cox的含量抑制ADP诱导的兔血小板聚集。

莫诺苷；血小板聚集；环氧酶；兔

[本文著录格式]孙盼莉，魏守蓉，王晓锋，等.莫诺苷对二磷酸腺苷诱导兔血小板聚集后环氧酶的影响[J].中国康复理论与实践,2012,18(4):331-332.

莫诺苷(morroniside)是本实验室从常用中药山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)的有效成分环烯醚萜苷中分离得到的单体化合物，对其前期研究发现，莫诺苷对人神经母细胞瘤细胞系具有抗氧化应激、抗凋亡、抗细胞钙超载及促进神经营养因子释放等保护作用[1-5]；能减小大鼠局灶性脑缺血再灌注模型脑梗死体积[6]，增强皮层抗炎能力[7]。此外，莫诺苷能显著抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)和血小板活化因子(platelet activation factor,PAF)诱导的兔血小板聚集，尤其对ADP的抑制作用选择性强[8]。环氧酶是阿司匹林(acetyl salicilic acid,ASA)抗血小板聚集的作用靶点，本文则通过体外研究莫诺苷在ADP诱导血小板聚集后对环氧酶含量的影响，进一步从分子角度探讨莫诺苷抗血小板聚集的可能机制。

1 材料与方法

1.1药物 莫诺苷由本室从山茱萸中提取制备，高效液相分析，纯度约98.5%，临用前用蒸馏水溶解成所需浓度。ASA为SIGMA公司产品，临用时用蒸馏水溶解，以0.1mol/L NaHCO3调pH至7.0左右，再加蒸馏水稀释到所需浓度。

1.2试剂 ADP(SIGMA公司)配制成7.5 mg/m l储存液，分装，-20℃密封保存，临用前稀释，终浓度为10μmol/L；环氧酶(cycloxygenase,Cox)ELISA试剂盒(R&D公司)。

1.3动物及仪器 新西兰大耳白兔：体重(3.0±0.5) kg，SPF级，由北京开源兔业养殖场提供，合格证号SCXK(京)2006-0005；SC-2000 M icrofuge低温离心机(美国BECK-MAN公司)；IMT22型全自动酶标仪(LP400型)(法国Diagnostic Pasteur)。

1.4方法

1.4.1血小板的制备[9]2.5～3 kg雄性新西兰大耳白兔，经兔颈总动脉取血，枸橼酸钠抗凝(1∶9)，取230 g离心10 m in，取上清得富含血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)；PRP 800 g离心15m in，得沉淀即血小板。

1.4.2负载血小板悬液的制备 配制无钙Hepes buffer和1mmol/L含钙Hepesbuffer血小板经无钙Hepesbuffer洗涤2次；再用1 mmol/L含钙Hepes buffer重悬。取悬液分组即空白对照组，莫诺苷低、中、高剂量组，ASA组，每组5份，各取上述悬液300µl待用。

1.4.3加药作用及离得样品 莫诺苷低、中、高剂量组分别加浓度为3.0mg/m l、6.0mg/m l、12.0mg/m l的莫诺苷溶液各10µl，ASA组加0.5 mg/m l的ASA溶液10µl，空白对照组加等体积的生理盐水，与血小板悬液作用5m in；加ADP(终浓度为10μmol/L)诱导血小板聚集5m in；然后各组加入0.1mol/L HCl 20µl终止炎症反应；最后14000 r/m in离心2m in，取得上清用于测定Cox的含量。

1.4.4 Cox含量 按Cox ELISA试剂盒(R&D)操作[10]测定Cox活性。

1.5统计学分析 采用SPSS 13.0统计学软件进行统计处理。组间样本均数比较用单因素方差分析(one-way analysisof variance,ANOVA)，显著性水平α=0.05。

2 结果

Cox作为ADP诱导血小板聚集过程中的重要物质，其含量可一定程度反映血小板聚集程度。与空白对照组相比，ASA组显著抑制血小板聚集Cox酶活性的增强，抑制率达到40%左右，表明血小板聚集功能正常，而ASA可较强地抑制血小板聚集引起的Cox酶活性的增强。与空白对照组相比，莫诺苷低、中、高剂量组均可降低ADP诱导血小板聚集引起的Cox酶活性增强，并具有较好的浓度依赖性，其中高剂量组(12mg/m l)的抑制率达30%左右。见表1。

表1 莫诺苷对ADP诱导的血小板聚集Cox含量的影响

3 讨论

心脑血管疾病的发病率、死亡率及致残率均高，近年来我国的流行病学资料表明，其在人口死因顺序中城市居第1位、农村居第2位，给社会和国家带来巨大的负担。随着研究的进展，人们越来越认识到血小板在动脉系统血栓形成中的关键作用，心脑血管疾病具有相似的病理生理机制和药物治疗手段。由于能控制凝血酶的生成及其活性，抗血小板治疗已成为预防和治疗动脉系统血栓的基石。抗血小板聚集的治疗在防治该类疾病中的作用更是得到广泛证实。药物的选择也不仅仅是ASA，其他药物如氯比格雷、西洛他唑、替罗非班等对心脑血管病的重要治疗作用已得到证实并广泛应用于临床。尽管常用的抗血小板聚集药物如ASA在预防脑卒中和急性心肌梗死方面发挥着重要作用，但是长期服用容易造成胃溃疡、肾损害以及精神障碍等不良反应，而且药物反应性不同也影响其在治疗中的有效性。这些都激励着人们不断研制和寻找更好的新型抗血小板药物，其中中医中药学者也逐渐认识到血小板在血瘀症发病学和活血化瘀中药药理上起着重要作用，有抗血小板聚集作用的中药及其方剂运用于临床，研究活血化瘀中药的活性成分，进而开发出新药，是中药现代化研究的课题。一些单体化合物及有效成分在抗血小板聚集方面的作用也得到研究证实，如川芎嗪、芍药酚、银杏内酯、姜黄酮、丹酚酸及人参皂苷等均有很好的作用。

在体内血小板聚集是极其复杂的过程，目前已知血小板的聚集反应至少通过ADP、血栓素A2和PAF等3条途径激活，而各种诱导剂如ADP、AA、PAF等均可通过上述不同途经激活血小板聚集。在前期的研究中，已知莫诺苷可以不同程度抑制ADP、AA、PAF诱导的兔血小板聚集，尤其是对ADP诱导的兔血小板聚集有较好的选择性。本文着重通过测定莫诺苷是否能够抑制ADP诱导后Cox活性，初步探讨莫诺苷抑制血小板聚集的可能机制。从实验数据来看，莫诺苷可以不同程度抑制ADP诱导兔血小板聚集后Cox的生成。从分子机制证明莫诺苷可能通过减少Cox的含量，抑制兔血小板聚集。但是由于体内血小板聚集机制复杂，涉及到多种因素，因此对于莫诺苷抗血小板聚集机制探索还有待于更进一步的研究。

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Effects of M orroniside on Cycloxygenase after Platelet Aggregation Induced by Adenosine Diphosphate in Rabbits

SUN Pan-li, WEIShou-rong,WANG Xiao-feng,etal.TongjiMedical College ofHuazhong University ofScience and Technology,Wuhan 430030,Hubei, China

Ob jectiveTo investigate the effect ofmorroniside on cycloxygenase(Cox)in the condition of platelet aggregation induced by adenosine diphosphate(ADP)in rabbits.M ethodsThe levels of Cox induced by ADP in different groups were detected by enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA).Results Compared w ith the control group,all themorroniside groups significantly inhibited the increase of Cox induced by ADP(P＜0.001),which had concentration dependence,and the inhibition rate of high dose group was 30%.Conclusion M orroniside can decrease the level of Cox and itmay be themechanism ofmorroniside on inhibiting the platelet aggregation induced by ADP in rabbits.

morroniside;plateletaggregation;cycloxygenase;rabbits

R285.5

A

1006-9771(2012)04-0331-02

2011-10-18)

1.“重大新药创制”科技重大专项(2009ZX 09103-366)；2.国家自然科学基金项目(81173575，30740053)；3.北京市自然科学基金项目(7062031)；4.北京市教委(PXM 2011_014226_07_000071)；5.2011年北京市卫生系统高层次卫生技术人才。

1.华中科技大学同济医学院，湖北武汉市430030；2.首都医科大学宣武医院，北京市100053；3.中国医学科学院药物所，北京市100050。作者简介：孙盼莉(1985-)，女，湖北武汉市人，硕士研究生，主要研究方向：缺血性脑损伤。通讯作者：魏守蓉。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.04.005