任务导向性训练对局灶性脑梗死大鼠前肢运动功能及缺血区突触素和生长相关蛋白-43表达的影响①

王艳，唐强，朱路，刘宏光，张春艳

·基础研究·

任务导向性训练对局灶性脑梗死大鼠前肢运动功能及缺血区突触素和生长相关蛋白-43表达的影响①

王艳，唐强，朱路文，刘宏光，张春艳

目的观察任务导向性训练对局灶性脑缺血大鼠前肢运动功能和缺血区周围皮质突触素和生长相关蛋白(GAP)-43表达的影响。方法采用内皮素-1(ET-1)诱导局灶性脑缺血大鼠前肢损伤模型。将大鼠随机分为假手术组、模型组、任务导向组和跑台组，每组又分为3 d、7 d、14 d、21 d 4个亚组，每个亚组各6只。造模后24 h对任务导向组进行前肢抓取训练，跑台组给予跑台训练，模型组不给予任何干预。用网屏实验分析大鼠的运动功能，应用免疫组化方法观察各组不同时间点缺血灶周围皮质突触素和GAP-43表达。结果造模后14 d和21 d任务导向组大鼠前肢运动功能优于模型组(P＜0.01)和跑台组(P＜0.05)。任务导向组缺血区周围皮质突触素平均光密度值在造模后14 d和21 d优于模型组和跑台组(P＜0.05)；任务导向组缺血区周围皮质GAP-43阳性细胞数量在造模后7 d和14 d优于模型组和跑台组(P＜0.05)。结论任务导向性训练法可促进局灶性脑缺血大鼠前肢运动功能的恢复，疗效优于动物跑台训练，其机制可能是与增强脑缺血区周围皮质突触素和GAP-43的表达有关。

任务导向性训练；脑缺血；前肢运动功能；突触素；生长相关蛋白-43；跑台训练；大鼠

[本文著录格式]王艳，唐强，朱路文，等.任务导向性训练对局灶性脑梗死大鼠前肢运动功能及缺血区突触素和生长相关蛋白-43表达的影响[J].中国康复理论与实践,2012,18(4):319-323.

脑卒中导致脑部损伤和随后由于部分脑功能丧失而造成缓慢而不完全的康复，严重危害人类生命健康[1]。脑卒中后存活下来的大部分患者均存在肢体功能障碍，严重影响生活质量[2]。上肢功能障碍尤为严重[3]，它不仅影响粗大动作的技能，更影响精细动作的完成，从而影响患者日常生活活动，降低其生活独立性。但由于上肢及手功能的复杂性，脑卒中后其功能的恢复往往不尽人意[4]。如何有效地促进脑卒中患者上肢功能的恢复，是我们康复临床的一个重要课题。本实验通过观察任务导向性训练与动物跑台训练对局灶性脑缺血大鼠前肢运动功能及缺血区周围突触素(synaptophysin,Syn)和生长相关蛋白-43(grow th associated protein-43,GAP-43)表达的影响，探讨脑卒中后促进上肢功能恢复的更为有效的康复方法。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 清洁级健康雄性SD大鼠96只，体重250～300 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供(许可证号SCXK(黑)2008001)。采用随机区组法将符合标准的96只雄性大鼠分为4组：假手术组、模型组、任务导向组和跑台组，各组再按脑缺血后不同时间点分为3 d、7 d、14 d、21 d 4个亚组，每组每个时间点各6只大鼠。

1.2实验试剂和仪器 试剂：内皮素-1(endothelin-1, ET-1)(武汉博士德公司)；突触素和CAP-43多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；二步法免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。仪器：莱卡2135型切片机(德国)；M oticam3000显微摄影成像系统(美国)；大鼠立体定位仪；华佗牌针灸针(直径0.25 mm，苏州医疗用品有限公司)；前肢抓取训练盒：参照周佳丽等[5]制作的“抓取测试盒”。训练盒分三个部分：上方为通道；左侧下方为食槽和所连接的阶梯式斜坡，在通道底板左侧有与食槽连接的缝隙；下方为食槽，通道口一端有与地面连接斜坡，便其大鼠爬入训练盒中。

1.3方法

1.3.1造模 造模前预训练：造模前14 d开始对大鼠进行前肢抓取食物(瓜子)能力训练，每天早晚(空腹)各训练1次，每次15m in。手术前还要经过适应性跑台训练3 d，30m in/d，速度：10m/m in，坡度：0°。

模型制备：参照Gary[6]采用ET-1诱导局灶性脑缺血大鼠前肢损伤模型。首先，大鼠用水合氯醛腹腔麻醉后，将其俯卧于大鼠脑立体定位仪上，于颅顶中线切开皮肤，暴露颅骨。以前囟点和脑中线为标志，分别在前囟点向左旁开3mm、前囟点向前1mm，向左旁开3mm、前囟点向前2mm，向左旁开3mm，用微孔钻在以上3个位置钻孔。将ET-1(用生理盐水稀释1 µg/µl)放于微量注射器中，在以上各点注射(共0.33 µl)，每点分别向下1.5mm，以30 s的速度将0.1µl的 ET-1注射到每个点上，剩下的0.03µl在最后一点以10 s速度注射完，停留5m in后出针。缝合伤口，并在局部进行消毒防止伤口感染。在手术过程中保持大鼠直肠温度在(37±5)℃。造模后2 h内所有大鼠被严密监护。实验室温度控制在(25±1)℃，12 h光暗交替(7:00-19:00照明)，除术前后数日外，食物的摄入量维持在领取时体重的85%，不控制饮水。

1.3.2干预方法

1.3.2.1假手术组 只手术，不造模。大鼠置于笼中饲养，按时间点网屏测试运动能力后处死采集标本。

1.3.2.2模型组 大鼠造模后不给予任何处置，按时间点网屏测试运动能力后处死采集标本。

1.3.2.3任务导向组 造模24 h后仅给予前肢抓取食物能力训练，方法同造模前预训练。

1.3.2.4跑台组 造模24 h后，将大鼠置于不断向后传输的履带上，为避免履带尾部电栅栏的电击，大鼠不断地在电动履带上主动向前奔跑。30m in/d，速度：10m/m in，坡度：0°。

1.4运动功能评定 网屏实验[7]：评分分为4个等级，0分：前抓握住网屏大约5 s，不会掉下来；1分：暂时握住网屏，滑落一段距离，但没有掉下来；2分：在5 s内掉下来；3分：网屏转动时，鼠即刻掉下来。

1.5标本采集及指标检测

1.5.1标本采集 将各组大鼠麻醉后固定于手术台，暴露心脏后用生理盐水和4%多聚甲醛(pH=7.4)进行心脏冲洗和灌注后断头取脑，将脑组织存放入4%多聚甲醛溶液固定6 h，以备观察免疫组织化学。

1.5.2指标检测 经脱水—透明—浸蜡—包埋—切片—脱蜡—脱水，PBS冲洗2m in×3次。滴加一抗(突触素多克隆抗体，GAP-43多克隆抗体)，PBS冲洗2m in×3次。滴加相应二抗，PBS冲洗2 m in×3次。DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木素复染，常规脱水、透明、封片，显微镜下观察。

1.6图像处理 采用美国M oticam3000显微摄影成像系统，每只大鼠选取3张切片，每张切片在显微镜下随机选取3个高倍(400×)视野，观察GAP-43阳性细胞数目(棕黄色颗粒)。采用M otic ImagesAdvanced 3.2图像软件，测定突触素免疫反应阳性产物的平均光密度值。

1.7统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件进行分析。组间比较用单因素方差分析，若方差齐，则采用LSD法进行分析，若方差不齐，则采用Dunnett法进行分析。

2 结果

2.1运动功能 假手术组大鼠麻醉苏醒后活动正常，说明假手术本身并未对大鼠的神经功能造成影响。

模型组各时期运动功能评分显著高于假手术组(P＜0.001)。任务导向组在3 d和7 d时评分与模型组无显著性差异(P＞0.05)，14 d和21 d时评分明显低于模型组(P＜0.01)。跑台组各时期评分与模型组无显著性差异(P＞0.05)。跑台组在3 d和7 d时评分与任务导向组无显著性差异(P＞0.05)，14 d和21 d评分高于任务导向组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠不同时间点的运动功能评定比较

2.2突触素的表达 突触素阳性细胞呈现黄色，主要表达在缺血区周围神经元突触上，少数毛细血管内皮胞质亦有表达，呈现大面积的点状及片状黄色区。各组突触素在3 d时开始出现，但阳性反应较弱，随着治疗时间及方式不同，至21 d时其颜色逐渐加深至棕黄色。

模型组在3 d、7 d时突触素平均光密度值低于假手术组(P＜0.05)，14 d、21 d时与假手术组无显著性差异(P＞0.05)。任务导向组在3 d、7 d时突触素平均光密度值与模型组无显著性差异(P＞0.05)，14 d、21 d时高于模型组(P＜0.05)。跑台组3 d、7 d、14 d时突触素平均光密度值与模型组无显著性差异(P＞0.05)，21 d高于模型组(P＜0.05)。跑台组3 d、7 d时突触素平均光密度值与任务导向组无显著性差异(P＞0.05)，14 d、21 d时低于任务导向组(P＜0.05)。见表2。

表2 各组缺血区周围皮质突触素平均光密度值比较

2.3 GAP-43的表达 GAP-43阳性细胞呈现黄色或棕黄色，主要表达在缺血区周围神经元胞质中，胶质细胞少量表达。各组GAP-43在3 d时均有所表达，到7 d时达到高峰，随后亦有不同程度下降。

模型组在3 d、7 d、14 d时阳性细胞多于假手术组(P＜0.05)，21 d时与假手术组无显著性差异(P＞ 0.05)。任务导向组在3 d时阳性细胞与模型组无显著性差异(P＞0.05)，在7 d、14 d时高于模型组(P＜0.05)，21 d时显著高于模型组(P＜0.001)。跑台组在3 d、7 d、14 d时阳性细胞与模型组无显著性差异(P＞0.05)，21 d时高于模型组(P＜0.05)。跑台组在3 d、14 d时阳性细胞与任务导向组无显著性差异(P＞0.05)，7d、21 d时低于任务导向组(P＜0.05)。见表3。

表3 各组缺血区周围皮质GAP-43阳性细胞数比较(n)

3 讨论

本研究目的是比较任务导向性训练与动物跑台训练对局灶性脑梗死大鼠前肢运动功能及缺血区周围突触素和GAP-43表达的影响。本研究结果显示，任务导向性训练对局灶性脑梗死大鼠前肢运动功能及缺血区周围突触素和GAP-43表达优于动物跑台训练。

大脑的可塑性研究证明，脑的功能重组依赖于任务导向性训练的反复强化[8-9]。任务导向性训练对运动功能的促进作用机制在于：①反复的任务导向性训练影响中枢神经系统的适应性，从而促进脑功能的重组[10]；②任务导向性训练能使神经功能细胞向病灶部位定向迁移，最终形成新的神经网络，目前已从功能磁共振成像(fMRI)研究中得到证实[11]；③任务导向性训练针对功能障碍，效果显著；④任务导向性训练强调目标及任务的具体性而非抽象性。比如大鼠前肢抓取食物，这是一项具体的任务，操作时涉及到视觉和触觉的输入，大脑对信息的判断和整合以及神经对运动的有效支配等，再经过失败和成功的反馈，不断调整运动模式，形成优化的神经网络和运动程序，支配相关肌肉特定的顺序、速度和力量等力学特点，配合完成这项具体任务，促进发展适应能力、前馈能力和协调能力[12]；⑤任务导向性训练强调反复强化，训练不仅要具有功能性，还要有一定量的积累，这样才能促进中枢神经系统的功能重建；⑥任务导向性训练强调主动参与性。主动运动对调整神经网络以形成最佳运动模式起着重要作用[12]。

动物跑台训练作为一种康复手段已经广泛应用于临床与动物实验中。有研究显示，动物跑台训练能缩小脑梗死体积，促进神经功能的恢复[13]。但也有研究显示，动物跑台训练作为一种强迫式运动能增加血清皮质醇的含量，增加慢性应激，对脑卒中的康复有着负面的影响[14-16]。与本研究的结果相似。

GAP-43是一种与神经轴突生长相关的磷酸蛋白，其含量在生长及再生的神经组织中尤其在生长锥内非常高，故常被作为了解神经组织生长和再生情况、衡量其可塑性大小的一个指标。通过对GAP-43分布、含量及表达的测定，可以准确了解神经纤维增生的部位与程度。突触素是一种分子量为38 KDa的糖蛋白，定位于各种神经末梢的突触前囊泡上，可作为突触前膜的特异性标志。它与突触的形成有关，其含量高低可准确反映突触数目的多少。因此，GAP-43、突触素等与神经可塑性密切相关，其基因表达与蛋白含量的变化可直接影响到相互联系的神经元数目、突触数量，被认为是神经可塑性的标志蛋白[17]。

本实验结果显示，大鼠局灶性皮质性脑缺血造模后，突触素阳性细胞表达在第3天较弱，第7天开始逐渐升高，至第21天继续维持高水平，与Bolay等[18]的研究相似。胡昔权等在大鼠脑梗死造模第3天GAP-43阳性神经元数量表达逐渐升高，第7天达高峰，随后又明显下降[17]，提示该时期缺血的大脑正处于可塑性和功能重组的活跃状态。以上研究结果与本实验结果基本一致。任务导向性训练可以促进突触素表达并保持较高水平，并对GAP-43可以提高阳性表达，并延缓其下降的趋势。在形为学评分上，造模后各组7 d和21 d网屏实验评分，任务导向组均高于同期跑台组和模型组。

综上所述，本研究表明任务导向性训练能促进脑梗死大鼠前肢的运动功能的康复，其机制可能与脑梗死灶边缘皮质GAP-43和突触素的表达上调有关。有待于进一步的研究。

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Effects of Task-oriented Training on Forelim b M otor Function and Exp ression of Synap tophysin and G row th Associated Protein-43 in Ratsafter Focal Cerebral Ischem ia

WANG Yan,TANG Qiang,ZHU Lu-wen,etal.The Second Affiliated Hospital ofHeilongjiang University ofChinese Medicine,Harbin 150001,Heilongjiang,China

Ob jectiveTo explore the effects of task-oriented training on forelimb motor function and expression of synaptophysin and grow th associated protein(GAP)-43 in rats after focal cerebral ischem ia.M ethodsEndothelin-1(ET-1)was used to induce focal cerebral ischem ia model in rats w ith forelimb dysfunction.The rats were random ly divided into 4 groups:sham operation group,model group, task-oriented training group and treadm ill running group,each group was divided into 4 subgroupsby 3 d,7 d,14 d,and 21 d.24 hours after modeling,the rats in task-oriented training group were trained w ith forelimb reaching and the rats in the treadm ill running group were trained by treadm ill,and themodel group had no intervention.Motor function of rats was evaluated by net screen test,and immunohistochem istry staining was used to observed the expression of GAP-43 and synaptophysin in cortical ischem ia lesions of the rats in each group at different time points.Resu ltsThe scores of behavioral tests were better in the task-oriented training group than in themodel group(P＜0.01)and the treadm ill group(P＜0.05)on the 14th and 21st days aftermodeling.The expression of GAP-43 was higher in the task-oriented training group than in themodel group(P＜0.05)and the sham group(P＜0.01)on the 7th and 21st days aftermodeling.The expression of synaptophysin was higher in the task-oriented training group than in themodelgroup(P＜0.05)and the sham group(P＜0.05)on the 14th and the 21stdaysaftermodeling.ConclusionTask-oriented training can facilitate the recovery of forelimbmotor function of ratsafter focal cerebral ischem ia,and itmay be partially related to the up-regulation of expression of GAP-43 and synaptophysin in peri-infarction cortex.

task-oriented training;cerebral ischem ia;forelimbmotor function;synaptophysin;grow th associated protein-43;treadm ill running;rats

R743.3

A

1006-9771(2012)04-0319-05

2012-03-12)

哈尔滨市科技局科技创新人才专项基金(2011RFXYS072)。

黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨市150001。作者简介：王艳(1967-)，女，辽宁庄河县人，博士研究生，主任医师，主要研究方向：神经损伤康复。通讯作者：唐强。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.04.002