中药筋脉通对高糖培养海马神经元细胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响①

郭蕾蕾，张宏，田国庆，梁晓春

中药筋脉通对高糖培养海马神经元细胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响①

郭蕾蕾1a，张宏1b，田国庆1a，梁晓春1a

目的探讨中药筋脉通含药血清对高糖培养海马神经元细胞的保护作用。方法采用血清药理学方法制备筋脉通含药血清(JMT)，原代培养新生鼠海马神经元细胞分别接种于不同条件的培养基中，分为正常对照组、高糖组、阳性对照组以及JMT大、中、小剂量组。不同培养基中培养72 h后使用Western blotting检测其Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达。结果与正常对照组相比，高糖组Caspase-3、Bax表达明显增加(P＜0.01)，Bcl-2的表达下降(P＜0.05)；与高糖组相比，阳性对照组和JMT各剂量组的Caspase-3、Bax表达明显下降(P＜0.01)，Bcl-2的表达升高(P＜0.05)；与阳性对照组相比，JMT各剂量组的Caspase-3、Bax表达下降(P＜0.05)，筋脉通大、中剂量组Bcl-2的表达增加(P＜0.05)。结论筋脉通含药血清可能通过提高Bcl-2蛋白的表达，减少Bax、Caspase-3的表达，上调Bcl-2/Bax的比值，从而减少海马神经元细胞的凋亡。

糖尿病；认知功能障碍；筋脉通；海马神经元；Bax；Bcl-2；Caspase-3

[本文著录格式]郭蕾蕾，张宏，田国庆，等.中药筋脉通对高糖培养海马神经元细胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响[J].中国康复理论与实践,2012,18(4):324-328.

随着糖尿病发病率的逐年增加，糖尿病导致的学习记忆功能障碍日益受到人们的重视。一方面，糖尿病可明显增加痴呆的发生风险，包括血管性痴呆(vascular dementia,VD)和阿尔茨海默病(A lzheimer's Disease,AD)；另一方面，糖尿病可以导致患者轻、中度认知功能的下降，表现为轻、中度学习、记忆和执行能力的下降[1]。多种因素参与糖尿病认知功能下降的复杂病理过程，其中高血糖对脑神经元的影响是不可忽略的重要因素[2]，而与学习记忆活动关系密切的海马更容易受到血糖水平的影响[3]。中药筋脉通胶囊是北京协和医院的内部制剂，长期应用于临床，对糖尿病及其周围神经病变等慢性并发症具有较好的疗效[4]。本实验以原代培养海马神经元细胞为靶细胞，观察筋脉通含药血清对高糖环境下海马神经元相关凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表达的影响，以期探讨中药筋脉通对高糖培养海马神经元细胞的保护作用。

1 材料

1.1 动物 出生24 h SD新生鼠15只，体重约4～6 g，购自北京华阜康生物科技有限公司，合格证号：SCXK(京)2009-2007。SD雄性大鼠38只，体重280～320 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可号：SCXK(京)2007-0001。

1.2主要试剂与药品 DMEM高糖培养基(北京协和细胞资源中心)；优质胎牛血清(characterized fetalbovine serum,FBS)、0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA(Hyclone)；多聚左旋赖氨酸(polylysine,PLL)(SIGMA)；神经元生长因子(nerve grow th factor,NGF)(Invirtogen)；FITC标记山羊抗兔IgG(中杉金桥)；兔抗鼠Enolase(NSE)、activated Caspase-3、Bcl-2、Bax多克隆抗体(Bioworld)；HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)(Jackson)；兔抗鼠β-actin多克隆抗体(Santa cruz)；Caspase抑 制剂 Z-VAD-FMK(碧 云 天)； 即 用 型 Annexin-V-FLUOS试剂盒(Roche)；PVDF膜，0.45μm孔径(M illipore)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)；SDS (SIGMA)；ECL发光液(M illipore)；筋脉通胶囊(由菟丝子、女贞子、水蛭、延胡索、桂枝、细辛等组成)，中国医学科学院北京协和医院院内制剂，由北京九龙制药厂加工生产，每粒含生药0.35 g，批准文号(97)京卫药制加字[48]第F-292号，生产批号：061019。

1.3主要仪器与设备 ALC PK 121R高速低温离心机；Thermo Fresco低温冷冻离心机；Forma 3111 CO2培养箱；Olympus CKX31SF倒置相差显微镜；Leica TCSSP2SE激光扫描共聚焦显微镜；M illipore Advantage A 10超纯水系统；Thermo M ultiSkanMK 3酶标仪；Cavoy M iniP-4电泳槽；Cavoy湿转电泳槽；Bio-Rad电泳仪。

2 方法

2.1含药血清及正常大鼠血清的制备 SPF级雄性SD大鼠38只，根据随机数字表法分为正常组(n=28)和筋脉通组(n=10)。适应性喂养24 h后开始灌胃。筋脉通组按成人剂量的15倍给药(即1.3125 g/kg∙d)，正常组给予同等体积的蒸馏水。每天灌胃2次，连续3 d。于末次灌胃后2 h内颈动脉取血，采集的全血室温静置2 h后，4℃ 4000 r/m in离心10 m in，分离血清，置-20℃冰箱保存备用，避免反复冻融。使用时56℃水浴灭活30m in，0.22μm滤器过滤，用正常大鼠血清分别按0∶1、1∶2、2∶1的比例稀释筋脉通含药血清即得筋脉通大、中、小剂量含药血清。

2.2细胞培养液的配制 DMEM完全培养基：180m l DMEM高糖培养基中分别加入FBS(终浓度10%)、谷氨酰胺(2 mmol/L)，丙酮酸钠(1 mmol/L)，Hepes(20 mmol/L)，双抗(青霉素100 U/m l，链霉素100μg/ m l)，NGF(10 ng/m l)。置4℃冰箱保存备用。

DMEM无血清培养基：除不加FBS外，余与DMEM完全培养基的配制相同。

2.3实验分组 使用DMEM完全培养基培养细胞至第3天时，更换为不同条件的培养基。各组培养基均含DMEM无血清培养基，其中正常对照组(NC)另加10%正常血清，其余各组均加50mmol/L葡萄糖，高糖组(HG)另加10%正常大鼠血清，阳性对照组(PC)另加10%正常血清和10mmol/m l Z-VAD-FMK，JMT大剂量组(JH)、中剂量组(JM)、小剂量组(JL)分别另加入10%筋脉通大、中、小剂量含药血清。

2.4海马神经元的分离、纯化与培养 出生24 h SD新生鼠，75%酒精浸泡5 m in，取出后置-20℃约3～5 m in，分离脑内两侧海马组织；用D-Hank's液冲洗2次后将组织剪碎至0.5～1.0mm，加入浓度为0.25%胰蛋白酶37℃消化约20m in；观察液体呈一定悬浊度即加入FBS终止消化，用200目细胞筛过筛，收集细胞悬液；将细胞悬液小心加入15m l离心管中淋巴细胞分离液(与细胞悬液的比例1∶1.6)的上层，2000 r/m in离心20m in，收集细胞层细胞；用D-Hank's液重悬细胞，1500 r/m in再次离心5 m in；弃上清，用DMEM完全培养基30m l重悬细胞，细胞计数后按一定的细胞密度接种于PLL包被的培养瓶或培养板中。

2.5海马神经元的鉴定 将细胞悬液以5×105细胞/孔的浓度接种到预先放置了盖玻片的6孔培养板中，培养至第3天取出盖玻片进行免疫荧光鉴定，共聚焦激光显微镜检测NSE的表达，检测步骤如下：①取出盖玻片，0.01M PBS浸洗后加入4℃预冷的4%多聚甲醛常温固定1 h；②0.01M PBS漂洗3次×2m in，加入0.1% Triton-X 100浸泡10 m in；③0.01 M PBS清洗3次×2 m in，加入山羊血清封闭液与非特异性蛋白结合，室温孵育20m in；④加入一抗即兔抗鼠NSE多克隆抗体(1∶10)，湿盒内37℃孵育1 h，阴性对照组以0.01M PBS代替一抗；⑤0.01 M PBS清洗3次×2m in，加入FITC偶联山羊抗兔IgG(1∶50)，37℃湿盒避光孵育1 h；⑥0.01 M PBS振洗6次×5m in，加入DAPI工作液封片；⑦使用共聚焦激光显微镜进行检测，所摄图像以Leica Confocal图像分析软件分析，每组计数15～20个细胞。

2.6Western blotting检测Bcl-2、Bax、Caspase蛋白表达 ①蛋白样品的制备：待检测的各组细胞样本加入预冷RIPA裂解液，冰上孵育20 m in，13000 r/m in，4℃离心，20m in，取上清；按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的使用方法，计算出各组蛋白浓度；补充RIPA调整各组蛋白浓度。②SDS-PAGE电泳：根据目的蛋白的分子量，制备10%分离胶和5%浓缩胶；蛋白样品中加入等量2×SDS-PAGE加样缓冲液，于100℃加热5m in使蛋白充分变性；冷却样品后，按顺序将处理好的样品加入浓缩胶加样孔内，样品15μl/孔，marker 3μl/孔，以SDS-PAGE电泳进行蛋白分离。③转膜：使用湿转法将分离胶上的蛋白转移到PVDF膜上；丽春红染色观察转膜效果；对照marker，剪出膜上的目的蛋白及内参蛋白β-actin的条带。④封闭：将膜完全浸泡于3%BSA-TBST中，摇床上室温封闭30 m in，TBST洗膜。⑤一抗孵育：分别加入1∶1000稀释的一抗即兔抗鼠Caspase-3、Bcl-2、Bax多克隆抗体，摇床上室温轻摇40m in后，4℃孵育过夜。⑥二抗孵育：TBST漂洗膜后，加入1∶1000稀释的二抗即HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)，摇床室温孵育40 m in，TBST漂洗。⑦蛋白检测：将ECL发光液加到膜上后反应3～5 m in，胶片曝光10 s～5 m in，显影2 m in，定影，所摄图像以LabWorks 4.6图像分析软件分析，记录各组目的蛋白及内参蛋白的灰度扫描值，每组重复3次。

2.7统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件包进行分析，所有数据采用(±s)描述，行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，显著性水平α=0.05。

3 结果

3.1海马神经元形态 倒置相差显微镜下观察，刚接种的海马神经元胞体呈圆形，体积小，折光性强，分布均匀；培养1 d后，大部分细胞伸出三四个短小的突起，其中有些细胞发生再聚合现象，细胞几乎全部贴壁；生长4 d后，神经元细胞体进一步增大，突起进一步增多并明显增长，连接形成稀疏的网络，神经元以多极神经元为主；培养7 d后，细胞体积继续增大，胞体饱满，突起增粗增长，分支增多，形成致密的网络。见图1。

图1 培养海马神经元细胞的形态

3.2海马神经元鉴定及纯度 培养3 d的细胞，NSE免疫荧光染色，胞浆和突起被染成绿色而胞核不被染色的为阳性细胞，所有细胞的胞核均被染成蓝色。见图2。

在共聚焦激光扫描显微镜下进行观察并拍照，以3个视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例为神经元纯度，经鉴定神经元纯度达90%以上。

3.3Western blotting检测各组Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达 各组内参蛋白β-actin的表达无显著性差异(P＞0.05)；与NC组相比，HG组Caspase-3、Bax表达明显增加(P＜0.01)，Bcl-2的表达下降(P＜0.05)，Bcl-2/ Bax的比值下降(P＜0.05)；与HG组相比，PC组和筋脉通各剂量组的Caspase-3、Bax表达均明显下降(P＜ 0.01)，Bcl-2的表达升高(P＜0.05)，Bcl-2/Bax的比值升高(P＜0.05)；与PC组相比，筋脉通各剂量组的Caspase-3、Bax表达下降(P＜0.05)，JH和JM组Bcl-2的表达增加(P＜0.05)，JL组Bcl-2的表达与PC组无显著性差异(P＞0.05)；筋脉通各剂量组之间相比，JH、JM、JL三组Caspase-3表达均具有显著性差异(P＜0.05)，Bcl-2/Bax的比值在三组间呈下降趋势，但无显著性差异(P＞0.05)。各组内参蛋白β-actin与目的蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2的灰度扫描值以及Bcl-2/Bax的比值见表1。

各组Caspase-3、Bax、Bcl-2和β-actin的Western blotting化学发光免疫印迹见图3。

表1 Western b lotting检测Caspase-3、Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax的表达

图2 培养的海马神经元(NSE免疫荧光染色，200×)

图3 各组Caspase-3、Bax、Bcl-2和β-actin Western blotting

4 讨论

海马组织是中枢神经系统维持完整的学习和记忆功能的重要结构，对血糖代谢平衡的变化尤其敏感。基于像素的形态学测量(voxel-based morphometry, VBM)分析脑磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)显示，糖尿病可导致海马体积的明显萎缩[5-7]。同时海马组织也是糖尿病患者大脑最先受累的结构，海马相关的记忆(近期或陈述性)缺陷也是最先受损的认知功能[6-7]。由于脑MRI所反应海马体积与实际神经元数量的体积是等价的[8]，因此，MRI示海马体积的下降显示了海马神经元的丢失。另外，研究发现海马体积的萎缩程度与糖化血红蛋白、糖尿病病程呈正相关，血糖控制不良的患者海马体积下降更明显[6,9-10]。动物实验发现，持续性高血糖可引起海马区神经元的凋亡，导致神经元密度下降[11-12]。可以推断，高血糖引起的海马神经元凋亡必然参与了糖尿病认知功能障碍的发生发展过程。

目前糖尿病认知功能障碍的发病机制并不明确，一般认为，高血糖引起的大脑缺血改变、氧化应激、非酶性蛋白糖基化、钙离子稳态的改变等是其中不可忽略的重要因素[13]。K lein和Waxman详细分析了糖尿病时神经元的分子改变，认为以上因素虽然可造成神经元的损伤，神经元基因表达的改变可能是糖尿病认知功能障碍新的发病机制[14]。细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序性死亡，涉及一系列基因激活、表达以及调控等主动过程。其中，Caspase被认为是一切凋亡信号转导的共同通路，Caspase-3是凋亡的主要执行者，是Caspase级联反应中关键的效应蛋白酶，一旦被激活，凋亡常难以避免[15]。Bcl-2家族在凋亡细胞内信号传导中起着重要作用，抗凋亡Bcl-2与促进凋亡的Bax具有高度同源性，可形成异源二聚体，两者之间比例的平衡可决定凋亡是否发生[16]。目前认为，Bax和Bcl-2蛋白可通过抑制细胞色素C的释放和Caspase的激活来调节细胞凋亡的发生。

本实验检测高糖环境下海马神经元细胞中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表达，发现HG组较NC组Caspase-3、Bax的表达明显增加，而Bcl-2的表达下降，导致Bcl-2/Bax比值下降。说明高糖可通过调节Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表达，从而促进海马神经元的凋亡。此结果与Stranahan、Norman等[11-12]的研究结果类似。可以推断，高糖可能是通过降低Bcl-2/Bax的比值达到一定“阈值”后，充分激活Caspase级联反应，最终促进神经细胞凋亡的发生。Caspase抑制剂Z-VAD-FMK是一种可以穿过细胞膜的泛Caspase抑制剂，可以抑制Caspase激活导致的细胞凋亡[17]。本实验使用Caspase-3抑制剂Z-VAD-FMK的阳性对照组和筋脉通各剂量组中Caspase-3、Bax的表达较高糖组明显下降，并且Bcl-2的表达升高，Bcl-2/Bax的比值升高，且筋脉通各剂量组对凋亡相关蛋白的调节作用显著优于阳性对照组并且呈一定浓度依赖性趋势。提示Caspase-3抑制剂和筋脉通含药血清对高糖环境下海马神经细胞凋亡的抑制作用可能是通过提高Bcl-2/Bax的比值，抑制Caspase-3的激活实现的；并且筋脉通含药血清对凋亡蛋白的调节作用优于Caspase-3抑制剂Z-VAD-FMK。

糖尿病认知功能障碍属于中医消渴病合并“呆症”、“健忘”的范畴，《圣济总录》中有“消渴日久，健忘怔忡”等认知功能损害的症状记载。《医学心悟》中有“肾主智，肾虚则智不足”之说，因此学习记忆障碍患者多有肾虚。另外，现代研究证实糖尿病患者多有血瘀[18]。故消渴呆症的基本病机为肾虚血瘀，络脉不通。因此，补肾活血通络是治疗糖尿病性认知功能障碍的根本大法。筋脉通主要由菟丝子、女贞子、水蛭、延胡索、桂枝、细辛等组成。菟丝子、女贞子归肝、肾经，两者配伍滋阴益肾，阴阳俱补；水蛭归肝经，具破血逐瘀之功，与女贞子、菟丝子配伍使得补肾与活血并行，祛邪而不伤正；延胡索性温，主要作用是活血化瘀、行气止痛，与水蛭同用加强活血化瘀的功效；桂枝、细心皆入肺、肾、心经，温阳通络，诸方共奏补肾养阴活血通络之效，符合糖尿病认知功能障碍的病机。同时，筋脉通组方中的齐墩果酸、香豆素、水蛭素、桂皮醛、细辛醚、黄酮类、苷类、生物碱类等单体或有效成分具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用。由此推断，筋脉通对高糖培养海马神经元凋亡可能具有一定的保护作用。至于筋脉通在体内环境下的作用及其确切机制尚有待于进一步的研究和探讨。

致谢

感谢中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所刘玉琴教授对本论文写作上的帮助。

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Effects of Jinm aitong on Exp ression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 in H ippocam pal Neurons Cu ltured w ith H igh G lucose

GUO Lei-lei,ZHANG Hong,TIAN Guo-qing,et al.Peking Union Medical College Hospital and Institute of Basic Medical Sciences,Peking Union Medical College,Chinese Academy ofMedical Sciences,Beijing 100730,China

Ob jectiveTo explore the effectof Jinmaitong(JMT)on expression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 in hippocampalneurons cultured w ith high glucose.M ethodsHippocam pal neuronsw ere primarily cultured and purified from the hippocampus of new-born Sprague Daw ley rats.Neuron-specific enolase immunocytochem icalmethod was adopted for the identification of the neurons.They were divided into normal controlgroup,high glucose group,high-dose JMT(JH)group,m iddle-dose JMT(JM)group,low-dose JMT(JL)group and a positive control group.72 hours later,Western blotting was adopted to detect the expression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3.Resu ltsCompared w ith the normal control group,the expression of Bax and Caspase-3 in the high glucose group significantly increased(P＜0.01),and the expression of Bcl-2 significantly decreased(P＜0.05).Compared w ith the high glucose group,the expression of Caspase-3 and Bax in the positive control group and JH,JM,and JL groups significantly decreased(P＜0.01),and the expression of Bcl-2 significantly increased(P＜0.05). Com pared w ith the positive control group,the expression of Caspase-3 and Bax significantly decreased in JH,JM,and JL groups(P＜0.05), and the expression of Bcl-2 significantly increased in JH and JM groups(P＜0.05).ConclusionJMTmay reduce apoptosis by inhibiting the expression of Bax and Caspase-3 and promoting the expression of Bcl-2.

diabetesmellitus;cognitive dysfunction;Jinmaitong;hippocampalneurons;Bax;Bcl-2;Caspase-3

R285.5；R587.1

A

1006-9771(2012)04-0324-05

2012-02-13)

首都医学发展科研基金项目(SF-2009-Ⅲ-29)。

1.中国医学科学院，北京协和医学院，a：北京协和医院；b：基础医学研究所，北京市100730。作者简介：郭蕾蕾(1986-)，女，山东临沂市人，硕士研究生，主要研究方向：糖尿病及其慢性并发症和肺癌的中西医防治。通讯作者：田国庆。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.04.003