卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺的测定

张凤梅，杨 柳，孟昭宇，吴亿勤，伊奥尔，牟定荣

(红塔烟草(集团)有限责任公司技术中心，云南 玉溪 653100)

烟草特有亚硝胺(TSNAs)是烟草中N-亚硝胺含量最丰富的一类亚硝胺物质，只存在于烟草、烟草制品和卷烟烟气中。目前研究较为深入的TSNAs包括N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)和4-(N-甲基-N-亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-丁酮(NNK)。由于对健康的关注，出现了一系列TSNAs的检测方法，主要集中在GC-TEA法[1]和LC-MS/MS法[2～4]。然而，GC-TEA法前处理纯化步骤多、分析周期长、溶剂耗量大、检测器专属性强、样品通量低、环境污染严重，LC-MS/MS法又需要SPE纯化的前处理步骤或不能很好地消除基质的干扰。为此，作者在前人工作的基础上，优化了LC-MS/MS前处理方法，建立了一种快速、准确的TSNAs测定方法。

1 实验

1.1 试剂与仪器

超纯水，甲醇、乙酸铵、乙酸为色谱纯。

标准品：NAB、NAT、NNK、NNN、NAB-d4、NAT-d4、NNK-d4和NNN-d4，纯度≥98%，加拿大TRC公司。

API3200QTRAP型质谱仪，美国应用生物系统公司；Waters Acquity型超高效液相色谱仪，美国Waters公司；Cerulean SM450型直线式吸烟机，Cerulean Ltd.；Milli-Q50型超纯水仪，美国Millipore公司；KQ-700DE型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；CP2245型电子天平(感量0.1 mg)，德国Sartorius公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流速0.4 mL·min-1；柱温40 ℃；进样量5 μL；流动相A：甲醇，流动相B：0.2%的乙酸溶液；梯度洗脱条件见表1。

表1 高效液相色谱梯度洗脱条件

1.3 质谱条件

离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压：5500 V；离子源温度：650 ℃；辅助气Gas1压力：0.345 MPa；辅助气Gas2压力：0.483 MPa；各分析物的定量离子对、定性离子对及碰撞能量(CE)见表2。

1.4 工作溶液

按浓度梯度为1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1配制NNN、NAB、NAT和NNK的标准溶液(甲醇为溶剂，内标NNN-d4、NAB-d4、NAT-d4和NNK-d4的浓度为10 ng·mL-1)。标准系列溶液的内标浓度与样品的内标浓度相同。

表2 质谱检测参数表

1.5 样品制备

将捕集了卷烟烟气的剑桥滤片放入50 mL锥形瓶中，准确加入10 mL含10 ng·mL-1内标的0.1 mol·L-1乙酸铵溶液超声萃取30 min后，静置5 min。取1 mL萃取液过0.22 μm的滤膜到色谱瓶中待分析。

2 结果与讨论

2.1 内标的选择

选择同位素内标法定量，分别考察了1种和4种内标对检测结果的影响。结果表明，选择1种内标NNK-d4定量NAB时，由于离子抑制作用和基质效应的存在，测量结果明显偏高，此结果与文献[4]的报道一致。为准确定量考虑，选择4种内标。

2.2 萃取方式的选择

对样品分别进行超声萃取30 min和振荡萃取30 min。结果表明，超声萃取30 min的萃取效率高于振荡萃取。故选择超声萃取的方式。

2.3 萃取时间的选择

对同一样品分别超声萃取10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、50 min。结果表明，超声萃取30 min以后，NAB、NAT、NNK、NNN的萃取效率均达到一个稳定值，为节约时间并避免引入更多的干扰成分，选择萃取时间为30 min。

2.4 精密度

对同一样品进行5次日内和日间平行性测定。结果表明，4种TSNAs日内、日间测定结果的相对标准偏差分别在1.30%～4.53%和1.25%～5.41%之间，说明方法的重复性较好。

2.5 工作曲线

取系列标准工作溶液分别进样，得到4种TSNAs的工作曲线，线性良好。取最低浓度标准溶液连续10次进样，计算测定结果的标准偏差，分别用3倍和10倍的标准偏差表示检出限和定量限。4种TSNAs的标准曲线回归方程、相关系数、检出限和定量限见表3。

表3 4种TSNAs的标准曲线回归方程、相关系数、检出限和定量限

2.6 回收率

对同一样品采用样品加标，在高、中、低三个含量水平进行了回收率的测定，平均回收率均在90%以上，表明本方法的回收率较高。

2.7 样品测定

对5种市售卷烟样品主流烟气中TSNAs进行测定，结果见表4。

表4 5种市售卷烟样品主流烟气中TSNAs含量测定结果/ng·cig-1

3 结论

建立了一种高效液相色谱-串联质谱联用法测定卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺的方法。采用含内标的0.1 mol·L-1乙酸铵溶液直接对收集了主流烟气的剑桥滤片进行超声萃取30 min，过膜后的萃取液用带电喷雾装置的LC-MS/MS仪进行分析。该方法数据可靠、操作简单、重复性好。

参考文献：

[1] 谢复炜，金永明，赵明月，等.国内外主要品牌卷烟主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的对比分析[J].中国烟草学报，2004，10(5)：8-15.

[2] 朱文静，杨俊，刘百战，等.HPLC-MS/MS对卷烟烟气中4种烟草特有亚硝胺的快速测定[J].分析测试学报，2010，(1)：26-30.

[3] Xiong Wei，Hou Hongwei，Jiang Xingyi，et al.Simultaneous determination of four tobacco-specificN-nitrosamines in mainstream smoke for Chinese Virginia cigarettes by liquid chromatography-tandem mass spectrometry and validation under ISO and "Canadian intense" machine smoking regimes[J].Analytica Chimica Acta，2011，674(1)：71-78.

[4] Wagner K A，Finkel N H，Fossett J E，et al.Development of a quantitative method for the analysis of tobacco-specific nitrosamines in mainstream cigarette smoke using isotope dilution liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Anal Chem,2005,77(4):1001-1006.