番茄黄化曲叶病毒山东泰安分离物的全基因组克隆与分析

刘文浩　仇平平　辛相启　苏文敏　王祥　竺晓平

摘 要：2011年春季在山东泰安保护地采集疑似番茄黄化曲叶病毒病症状的样品（SDTA），利用双生病毒的通用引物及DNA-A基因的全长引物对样品进行扩增并测序，得到共2 781 bp的核苷酸序列。序列比对发现，该样品与番茄黄化曲叶病毒安徽分离物（FN650807）同源性最高为996%，系统进化树表明，该样品是番茄黄化曲叶病毒，属于番茄黄化曲叶病毒以色列株系。

关键词：番茄黄化曲叶病毒；DNA-A；序列分析

中图分类号：Q781 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）11-0004-04

番茄黄化曲叶病（Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD）的病原是番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV），属于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），是一类由烟粉虱（Bemisia tabaci）传播的双生病毒。Begomovirus中大多数病毒是双组分病毒，主要由DNA-A和DNA-B两个组分组成，大小约为25～28 kb，少数病毒为单组分，即只有DNA-A。该病主要症状是植株上部叶片黄化，边缘上卷，叶片变小，下部叶片叶脉褪绿，植株明显矮化，不结果或结畸形果，严重影响番茄的产量。

1964年，番茄黄化曲叶病毒首次在爱尔兰岛发现。此后在亚洲、美洲、欧洲等地的许多国家也都有大面积的发生，目前已是热带和亚热带番茄的重要病害，成为了世界范围内影响番茄生产的首要限制因子[2～7]。自2006年以来，我国东部沿海地区陆续发现番茄黄化曲叶病，2007年该病害在山东地区大棚中零星发生，2009年在山东省保护地中流行，病株率一般为20%～30%，严重的达到60%～80%，在寿光大棚番茄主产区，病田率高达90%以上，常导致大棚重播，损失严重[8～13]。

本研究利用双生病毒通用引物[1]和DNA-A全长引物首次对泰安地区的疑似番茄黄花曲叶病毒的感病番茄样品进行了检测并对病毒分离物进行了全基因组扩增，利用同源性比对和系统进化分析等方法对其进行了分子鉴定。

1 材料与方法

11 样品采集

于2011年1月采自泰安市泰山区保护地中表现典型黄化曲叶病毒病症状的番茄植株，采集的样品于-20℃保存，病毒分离物命名为SDTA。

12 PCR扩增及序列测定

DNA提取采用北京天根公司的DNA提取试剂盒DP-305，参照说明书进行提取，提取的DNA于-20℃保存备用。以样品的总DNA为模板，参考谢艳等[1]设计的双生病毒的通用引物PA（5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′）和PB（5′-TGGACYTTRCAWJJBCCGCACA-3′）进行扩增。反应条件为94℃ 3 min；94℃ 40 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min[1]。

测序后与GenBank上已经登录的序列进行比对，设计DNA-A的全长引物TY3（5′-CAGTGGCTCGCAGAGGGT-3′）和TY5（5′-TTCGCAAGTATCAATCAAGGT-3′），扩增DNA-A全长序列。PCR反应条件为：94℃ 3 min；94℃ 40 s，56℃ 1 min，72℃ 3 min，35个循环；72℃ 10 min。以番茄黄化曲叶病毒毒源样品的DNA作阳性对照，以健康植株作为对照。

引物合成和序列测定均由上海博尚生物科技有限公司完成。

13 同源性分析及系统进化

将测得的序列上传到GenBank上，并进行BLAST分析。选取已经登录的中国各地和世界各地区代表性番茄黄化曲叶病毒序列（见表1），利用DNAStar进行同源性比对；并以番茄叶片卷曲病毒的越南分离物（TLCVV）为外组构建系统进化树，用Clustal W对序列进行对比分析，用MEGA 4软件，采用Kimura 2-parameter距离矩阵、邻位法（NJ）构建系统树，系统树各分支置信度（bootstrap）进行1 000次重复分析。

2 结果与分析

21 扩增结果及SDTA基因组DNA-A结构特征

用引物PA、PB对样品进行PCR扩增得到500 bp左右的特异片段（图1），用引物TY3、TY5对样品进行扩增得到27 kb左右的特异片段（图2），回收、测序后得到2 781 bp的序列，提交到GenBank，登录号为JF414236。

22 与已报道的番茄黄化曲叶病毒DNA-A同源性分析

BLAST分析结果显示，分离物SDTA的DNA-A基因全序列与番茄黄化曲叶病毒同源性最高；将其与中国不同地区和世界不同地区的双生病毒进行同源性比较，结果显示，SDTA与国内安徽地区分离物同源性最高为996%，确定为番茄黄化曲叶病毒的一个分离物。对病毒编码的各个基因比对结果表明，分离物SDTA与杭州、安徽和天津分离物的同源性最高，均在990%以上（表1）。

为了更好地分析其系统进化关系，选取全国不同地区有代表性的分离物以及国外其他地区引起番茄黄化曲叶病毒的分离物，以越南地区番茄叶片卷曲病毒（ToLCVV）为外组，构建系统进化树（图3）。结果表明，样品SDTA和来自中国杭州、安徽、天津等地的分离物亲缘关系较近，与美洲、亚洲等地的番茄黄化曲叶病毒同属于以色列番茄黄化曲叶病毒以色列株系（TYLCV-IL）。3 结论与讨论

按双生病毒的分类标准，根据地区和序列的不同将番茄黄化曲叶病毒分为以下几个株系：Tomato yellow leaf curl virus-Gezira（TYLCV-Gez）、Tomato yellow leaf curl virus–Isreal（TYLCV-IL）、Tomato yellow leaf curl virus-Mild（TYLCV- MLD）、Tomato yellow leaf curl virus-Iran（TYLCV-IR）及Tomato yellow leaf curl virus-Oman（TYLCV-OM）等[14]。由目前已报道的资料来看，TYLCV株系中以色列株系（TYLCV-IL）的分布最广。本研究的样品SDTA与以色列株系的同源性为977%，同属于一个分支。根据双生病毒科分类标准，病毒基因组核苷酸序列同源性小于89%就被定名为不同病毒，大于89%则被认

为是同一病毒的不同株系[15]。因此，我们认为样品SDTA与中国东南部沿海地区的番茄黄化曲叶病毒均属于番茄黄化曲叶病毒以色列株系（TYLCV-IL）的分离物。

番茄黄化曲叶病毒不能通过摩擦传毒，只能以烟粉虱以持久性方式传播，由于山东等地北方保护地独特的种植模式和种植环境，使得B型烟粉虱能够在保护地温暖的小气候中越冬为害，为番茄黄化曲叶病毒的传播和流行提供了有利条件，使得过去在国内南方流行的该病害得以在北方保护地中发生。分离物SDTA与安徽、浙江杭州、天津分离物亲缘关系最近，而且山东地区的番茄黄化曲叶病毒最早在鲁南地区发现并逐渐向鲁中的潍坊、淄博一带蔓延，因此推测山东泰安地区的病毒样品应该是从江浙地区经由鲁南传播而来，再通过鲁中、鲁北的蔬菜产区向北方的河北、天津等其他地区传播。参 考 文 献：

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