高浓度甲状腺素对软骨细胞聚集体（pellets）体外形成软骨组织的作用

刘瑾春等

[摘要]目的：药物浓度（100nM）甲状腺素对组织工程软骨形成的作用。方法：将软骨细胞聚集体分为常规培养组（DMED+10%FBS）和100nM甲状腺素组（DMED+10% FBS +100nM甲状腺素），体外培养1、2和3周取材进行大体形态、组织学、二型胶原和十型胶原免疫组化染色和软骨特异基因PCR分析。结果：100nM甲状腺素组形成的软骨细胞聚集体的体积和湿重均明显低于常规培养组，甲苯胺兰、二型胶原（ColⅡ）染色较常规培养组弱，软骨细胞特异基因的表达水平与常规培养组相似，软骨细胞肥大相关基因十型胶原（ColⅩ）及基质金属蛋白酶13（MMP13）的表达较对照组减弱，成骨方向分化相关基因（ColⅠ，Runx2）的表达与常规培养组相似。结论：高浓度甲状腺素能够抑制软骨细胞肥大，但同时也抑制了软骨细胞增殖和软骨细胞基质分泌。

[关键词]甲状腺素；软骨组织工程；软骨细胞；细胞外基质；细胞聚集体

[中图分类号]Q813.1[文献标识码][文章编号]1008-6455（2012）08-1324-04

软骨组织工程为软骨缺损修复提供了一种新的治疗方法[1]。软骨细胞是软骨组织工程种子细胞的一个重要来源，目前应用软骨细胞为种子细胞在体内外已经能够成功构建出精确形状的成熟软骨组织[2-3]。但是体外构建的组织工程软骨的生化和力学质量与生理软骨仍具有一定的差距[4]。在目前软骨细胞常规培养方案（主要为DMEM添加10%胎牛血清）基础上寻找新的优化成分是软骨组织工程的课题之一。

1材料和方法

1.3 软骨细胞pellets培养：第二代软骨细胞（P2）聚集体（pellets）根据培养基的不同分为2组，常规组培养基：低糖DMEM，10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素。100nM甲状腺素组：低糖DMEM，10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素，100nM甲状腺素。体外外培养1周，2周，3周分别取材进行大体、组织学及相关基因表达的检测。

1.4 组织学检测：取材后将标本放入4%多聚甲醛中固定24h，经脱水、石蜡包埋、切成5μm厚切片进行甲苯胺蓝染色观察细胞外基质中糖胺多糖（Glycosaminoglycan，GAG）分泌情况。应用鼠抗II型胶原单克隆抗体（Sigma）检测II型胶原表达情况。

1.6 统计学分析：计量指标均以均数±标准差的形式表示，所测数据采用t检验（Student's t-test）进行统计分析，P<0.05为具有显著性差异，统计软件包为SPSS Ver.16.0。

2结果

2.4 Col II和Col X免疫组化染色结果：两组pellets在第3天以及第1，2，3周的纵切面Col II和Col X染色见图4。第1周两组开始明显表达Col II，在培养3周时常规培养组Col II染色略强于100nM甲状腺素组。两组在培养第3天起即有Col X表达，在培养的3周过程中两组的ColX染色相当。

3讨论

本实验观察了药物浓度（100nM）甲状腺素对于体外组织工程软骨形成的作用。实验发现，高浓度的甲状腺素能抑制软骨细胞肥大以及成骨相关基因的表达，但同时使形成的软骨样组织减小，细胞外基质糖胺多糖和二型胶原的表达减少。

甲状腺素是机体内调节生长板软骨的生长和骨骼成熟的重要系统内分泌因子，甲状腺素直接刺激生长板软骨细胞的生长和成熟[11]。研究显示，甲状腺素低下的小鼠会出现骨骺板内软骨细胞增殖层和肥大层细胞减少，导致骺板厚度的降低，补充T4可以逆转这种生长板的紊乱，而补充生长激素则不能逆转这种紊乱，提示甲状腺素对软骨细胞增殖和成熟的作用[12]。在体外研究中也发现，低于或者近于生理浓度的甲状腺素（0.1～1.0nM）能够促进生长板软骨细胞转化为肥大软骨细胞，肥大标志基因碱性磷酸酶（ALP）的表达增加了130%[8]。甲状腺素对于软骨细胞形成典型的柱状排列的形态也有重要作用[13]。因此甲状腺素被认为是能够诱导软骨细胞成熟为肥大细胞的激素之一[14-15]。

研究显示，生理浓度甲状腺素对软骨细胞的克隆形成和增殖具有明显的抑制作用[16]，这一结果与本实验的MTT结果相似。本实验中，1nM甲状腺素组和100nM甲状腺素组的MTT值无统计学差异，说明甲状腺素对软骨细胞增殖的作用并无明显剂量依赖关系。生理浓度甲状腺素能够抑制小鼠软骨细胞pellets的Sox9基因的表达，并且促进软骨细胞肥大分化[17]。本实验发现，高浓度的甲状腺素抑制Sox9的作用仍旧存在，提示高浓度的甲状腺素引起软骨细胞改变的途径与与生理浓度下甲状腺素通过核受体引起软骨细胞相应改变的途径相同；但是与生理浓度不同的是，高浓度的甲状腺素反而抑制了软骨细胞的肥大分化，这一点与Guangyao Liu等[8]的研究结果相似：高于100nM的T3可以明显地抑制软骨细胞体外培养时的去分化和肥大分化，软骨肥大相关基因（ColX，MMP13）的表达均低于常规培养组。但是在Guangyao Liu等[8]的研究中，甲状腺素与胰岛素和骨形态发生蛋白2联合应用取得了较好的培养效果，而本实验单独应用了高浓度的甲状腺素并且发现抑制了软骨特异细胞外基质基因和蛋白的表达，因此推测高浓度甲状腺素是通过与胰岛素、骨形态发生蛋白2的信号通路相互作用而发挥药物作用的，联合应用后可能会有较好的效果。

本文探讨了高浓度甲状腺素对组织工程软骨形成的影响，显示高浓度甲状腺素能够抑制软骨细胞肥大及成骨分化，但同时也抑制了软骨细胞的增殖和分泌基质，从而为甲状腺素在软骨组织工程中的应用提供了参考。

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[收稿日期]2012-03-29[修回日期]2012-06-21

编辑/张惠娟